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I vettori di geni per u trattamentu di a fibrosi cistica pulmonaria devenu esse destinati à e vie aeree conduttive, postu chì a transduzione pulmonaria perifèrica ùn hà micca effettu terapeuticu.L'efficienza di a trasduzione virali hè direttamente ligata à u tempu di residenza di u trasportatore.Tuttavia, i fluidi di consegna, cum'è i trasportatori di geni, si sparghjenu naturalmente in l'alveoli durante l'inalazione, è e particelle terapeutiche di qualsiasi forma sò rapidamente eliminate da u trasportu mucociliariu.Allargà u tempu di residenza di i portatori di geni in u trattu respiratoriu hè impurtante, ma difficiuli di ottene.Particelle magnetiche cunjugate à u trasportatore chì ponu esse dirette à a superficia di e vie respiratorie ponu migliurà a destinazione regiunale.A causa di prublemi cù l'imaghjini in vivo, u cumpurtamentu di tali picculi particelle magnetichi nantu à a superficia di a via aerea in presenza di un campu magneticu applicatu hè pocu capitu.U scopu di stu studiu era di utilizà l'imaghjini di sincrotrone per visualizà in vivo u muvimentu di una seria di particelle magnetiche in a trachea di ratti anestetizzati per studià a dinamica è i mudelli di cumportamentu di particelle singole è in granu in vivo.Dopu avemu valutatu ancu se a consegna di particelle magnetiche lentivirali in presenza di un campu magneticu aumenterà l'efficienza di a trasduzione in a trachea di u ratu.L'imaghjini di raghji X di Synchrotron mostra u cumpurtamentu di e particelle magnetiche in campi magnetichi stazionari è in muvimentu in vitro è in vivo.E particelle ùn ponu micca facilmente trascinate nantu à a superficia di e vie aeree viventi cù i magneti, ma durante u trasportu, i dipositi sò cuncentrati in u campu di vista, induve u campu magneticu hè più forte.L'efficienza di a trasduzione hè stata ancu aumentata sei volte quandu e particelle magnetiche lentivirali sò state consegnate in presenza di un campu magneticu.Inseme, questi risultati suggerenu chì e particelle magnetiche lentivirali è i campi magnetichi ponu esse approcci preziosi per migliurà l'orientazione di i vettori di geni è i livelli di trasduzione in e vie aeree conduttive in vivo.
A fibrosi cistica (CF) hè causata da variazioni in un genu unicu chjamatu CFTR (CFTR).A proteina CFTR hè un canale ionicu chì hè presente in parechje cellule epiteliali in tuttu u corpu, cumprese e vie aeree, un situ maiò in a patogenesi di a fibrosi cistica.I difetti in CFTR portanu à u trasportu di l'acqua anormali, a desidratazione di a superficia di a via aerea, è a diminuzione di a prufundità di a capa di fluidu di a superficia di l'aria (ASL).Imperisce ancu a capacità di u sistema di trasportu mucociliariu (MCT) per sguassà e vie aeree di particelle inalate è patogeni.U nostru scopu hè di sviluppà una terapia genica lentivirali (LV) per furnisce a copia curretta di u genu CFTR è migliurà ASL, MCT è a salute di i pulmoni, è di cuntinuà à sviluppà e tecnulugia novi chì ponu misurà questi parametri in vivo1.
I vettori LV sò unu di i principali candidati per a terapia genica di fibrosi cistica, principalmente perchè ponu integrà permanentemente u genu terapeuticu in e cellule basali di e vie aeree (cellule staminali di a via aerea).Questu hè impurtante perchè ponu restaurà l'idratazione normale è l'eliminazione di u mucus differenziendu in e cellule di superficia di a via aerea corrette da geni funzionali assuciati à a fibrosi cistica, risultatu in benefici per a vita.I vettori LV anu da esse diretti contr'à e vie aeree conductive, postu chì hè quì chì l'implicazione pulmonale in CF principia.A spedizione di u vettore più profonda in u pulmone pò risultà in a trasduzione alveolare, ma questu ùn hà micca effettu terapeuticu in a fibrosi cistica.Tuttavia, i fluidi, cum'è i trasportatori di geni, migranu naturalmente in l'alveoli quandu sò inalati dopu à u parto3,4 è e particelle terapeutiche sò rapidamente espulse in a cavità orale da i MCT.L'efficienza di a trasduzione LV hè direttamente ligata à a durata di u tempu chì u vettore resta vicinu à e cellule di destinazione per permette l'assunzione cellulare - "tempu di residenza" 5 chì hè facilmente accurtata da u flussu d'aria regiunale tipicu, è ancu da l'assunzione coordinata di mucus è particelle MCT.Per a fibrosi cistica, a capacità di allargà u tempu di residenza LV in e vie aeree hè impurtante per ottene un altu livellu di trasduzione in questa zona, ma hè stata finu à avà sfida.
Per superà stu ostaculu, pruponemu chì i particeddi magnetichi LV (MPs) ponu aiutà in dui modi cumplementarii.Prima, ponu esse guidati da un magnetu à a superficia di a via aerea per migliurà u targeting è aiutà à e particelle di u trasportatore di geni à esse in l'area ghjusta di a via aerea;è ASL) si movenu in u stratu di cellula 6. I MP sò largamente usati cum'è veiculi di consegna di droghe mirati quandu si liganu à anticorpi, droghe di chimioterapia, o altre molécule chjuche chì si attaccanu à e membrani cellulari o si liganu à i so receptori di a superficia cellulare rispettivi è s'accumulanu à i siti di tumore in presenza di elettricità statica.Campi magneticu per a terapia di cancru 7. Altri metudi "ipertermichi" sò destinati à tumbà e cellule di tumore da riscaldamentu MPs quandu sò esposti à campi magnetichi oscillanti.U principiu di trasfezzione magnetica, in quale un campu magneticu hè utilizatu com'è agente di trasfezzione per rinfurzà u trasferimentu di DNA in e cellule, hè comunmente utilizatu in vitro cù una gamma di vettori di geni non virali è virali per linee di cellule difficili da trasduce. ..L'efficienza di a magnetotrasfezzione LV cù a consegna di LV MP in vitro in una linea cellulare di l'epiteliu bronchiale umanu in presenza di un campu magneticu staticu hè stata stabilita, aumentendu l'efficienza di trasduzione da 186 volte in paragunà cù u vettore LV solu.LV MT hè stata ancu applicata à un mudellu in vitro di fibrosi cistica, induve a trasfezzione magnetica hà aumentatu a trasduzione LV in culture d'interfaccia aria-liquida per un fattore di 20 in presenza di sputum10 di fibrosi cistica.In ogni casu, a magnetotransfezzione di l'organu in vivo hà ricivutu pocu attenzione è hè stata evaluata solu in uni pochi studii animali11,12,13,14,15, in particulare in i pulmoni16,17.In ogni casu, e pussibulità di trasfezzione magnetica in a terapia pulmonaria in fibrosi cistica sò chjaru.Tan et al.(2020) hà dichjaratu chì "un studiu di validazione nantu à a consegna pulmonale efficace di nanoparticelle magnetiche apre a strada per future strategie di inalazione CFTR per migliurà i risultati clinichi in i pazienti cù fibrosi cistica"6.
U cumpurtamentu di picculi particeddi magnetichi nantu à a superficia di e vie respiratorie in a prisenza di un campu magneticu applicatu hè difficiule di visualizà è studià, è per quessa sò pocu capitu.In altri studii, avemu sviluppatu un metudu di imaging X-Ray di cuntrastu di fasi basatu in a propagazione di sincrotrone (PB-PCXI) per l'imaghjini non invasivi è a quantificazione di cambiamenti in vivo minuti in a prufundità ASL18 è u cumpurtamentu MCT19,20 per misura direttamente l'idratazione di a superficia di u canali di gas. è hè usatu cum'è un indicatore iniziale di l'efficacità di u trattamentu.Inoltre, u nostru metudu di scoring MCT utilizza particelle di diametru di 10-35 µm composte di alumina o di vetru à altu indice di rifrazione cum'è marcatori MCT visibili cù PB-PCXI21.Tramindui i metudi sò adattati per l'imaghjini di una varietà di tippi di particelle, cumpresi MP.
A causa di l'alta risoluzione spaziale è temporale, i nostri saggi ASL è MCT basati in PB-PCXI sò adattati per studià a dinamica è i mudelli di cumportamentu di particelle singole è bulk in vivo per aiutà à capisce è ottimisà i metudi di consegna di geni MP.L'approcciu chì usemu quì hè basatu annantu à i nostri studii chì utilizanu a linea di fasciu SPring-8 BL20B2, in quale avemu visualizatu u muvimentu di fluidu dopu a consegna di una dosa di un vettore fittizio in e vie respiratorie nasali è pulmonari di i topi per aiutà à spiegà i nostri mudelli di espressione genica eterogenea osservati. in u nostru genu.studii animali cù una dosa di trasportatore di 3,4.
U scopu di stu studiu era di utilizà u sincrotronu PB-PCXI per visualizà i movimenti in vivo di una seria di MP in a trachea di i rati vivi.Questi studii di imaging PB-PCXI sò stati pensati per pruvà a serie MP, a forza di u campu magneticu è u locu per determinà u so effettu nantu à u muvimentu MP.Avemu presumitu chì un campu magneticu esternu aiutava a MF consegnata à stà o si move à l'area di destinazione.Questi studii ci anu ancu permessu di determinà cunfigurazioni magnetichi chì maximizanu a quantità di particeddi lasciati in a trachea dopu a deposizione.In una seconda serie di studii, avemu u scopu di utilizà sta cunfigurazione ottima per dimustrà u mudellu di trasduzione risultante da a consegna in vivo di LV-MP à e vie aeree di i rati, in l'assunzione chì a consegna di LV-MPs in u cuntestu di l'indirizzamentu di e vie aeree risulterà. in una efficienza di trasduzione LV aumentata..
Tutti i studii di l'animali sò stati realizati in cunfurmità cù i protokolli appruvati da l'Università di Adelaide (M-2019-060 è M-2020-022) è u Cumitatu d'Etica Animale SPring-8 Synchrotron.L'esperimenti sò stati realizati in cunfurmità cù i cunsiglii di ARRIVE.
Tutte l'imaghjini di raghji X sò state pigliate à a linea di fasciu BL20XU à u sincrotronu SPring-8 in Giappone utilizendu una configurazione simile à quella descritta prima21,22.In breve, a scatula sperimentale hè stata situata à 245 m da l'anellu di almacenamiento di sincrotron.Una distanza di mostra à u detector di 0,6 m hè aduprata per studii di imaghjini di particelle è 0,3 m per studii d'imaghjini in vivo per creà effetti di cuntrastu di fasi.Un fasciu monocromaticu cù una energia di 25 keV hè stata utilizata.L'imaghjini sò stati acquistati utilizendu un trasduttore di raghji X d'alta risoluzione (SPring-8 BM3) accoppiatu à un detector sCMOS.Le transducteur convertit les rayons X en lumière visible grâce à un scintillateur de 10 µm d'épaisseur (Gd3Al2Ga3O12), qui est ensuite dirigé vers le capteur sCMOS à l'aide d'un objectif de microscope ×10 (NA 0,3).U detector sCMOS era un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Giappone) cù una dimensione di array di 2048 × 2048 pixel è una dimensione di pixel cruda di 6.5 × 6.5 µm.Questa paràmetra dà una dimensione di pixel isotropicu efficace di 0,51 µm è un campu di vista di circa 1,1 mm × 1,1 mm.A durata di l'esposizione di 100 ms hè stata scelta per maximizà u rapportu signale-à-rumore di particelle magnetiche in l'internu è fora di e vie aeree minimizendu l'artefatti di muvimentu causati da a respirazione.Per studii in vivo, un otturatore rapidu di raghji X hè statu piazzatu in u percorsu di raghji X per limità a dosa di radiazione bluccà u fasciu di raghji X trà l'esposizione.
I media LV ùn sò micca stati utilizati in alcun studiu di imaging SPring-8 PB-PCXI perchè a camera di imaging BL20XU ùn hè micca certificata Livellu di Biosicurezza 2.Invece, avemu sceltu una gamma di MPs ben carattarizati da dui venditori cummirciali chì coprenu una varietà di dimensioni, materiali, cuncentrazione di ferru è applicazioni, - prima per capiscenu cumu i campi magnetichi affettanu u muvimentu di MP in capillari di vetru, è dopu vie aeree viventi.superficia.A dimensione di u MP varieghja da 0,25 à 18 µm è hè fatta da diversi materiali (vede a Tabella 1), ma a cumpusizioni di ogni mostra, cumpresa a dimensione di e particelle magnetiche in u MP, hè scunnisciuta.Basatu nantu à i nostri studii estensivi di MCT 19, 20, 21, 23, 24, aspittemu chì MP finu à 5 µm pò esse vistu nantu à a superficia di a trachea aerea, per esempiu, sottraendu frames consecutivi per vede una visibilità mejorata di u muvimentu MP.Un MP unicu di 0,25 µm hè più chjucu cà a risuluzione di u dispusitivu di imaghjini, ma PB-PCXI hè previstu di detectà u so cuntrastu volumetricu è u muvimentu di u liquidu di a superficia nantu à quale sò dipositati dopu à esse dipositu.
Campioni per ogni MP in a tavula.1 hè stata preparata in capillari di vetru 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) cù un diametru internu di 0,63 mm.I particeddi corpusculari sò dispunibuli in l'acqua, mentre chì i particeddi CombiMag sò dispunibuli in u liquidu propiu di u fabricatore.Ogni tubu hè à mità pienu di liquidu (circa 11 µl) è postu nantu à u supportu di mostra (vede a Figura 1).I capillari di vetru sò stati posti orizontali nantu à u palcuscenicu in a camera d'imaghjini, rispettivamente, è posizionati à i bordi di u liquidu.Un magnetu di nichel-shell di 19 mm di diametru (28 mm long) fattu di terra rara, neodimio, ferru è boru (NdFeB) (N35, cat. n. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) cù una remanenza di 1,17 T hè stata attaccata à un tavula di trasferimentu separata per ottene Remotamente cambià a vostra pusizione durante u rendering.L'imaghjini di raghji X cumincianu quandu u magnetu hè posizionatu à circa 30 mm sopra a mostra è l'imaghjini sò acquistati à 4 frames per seconda.Duranti l'imaghjini, u magnetu hè statu purtatu vicinu à u tubu capillare di vetru (à una distanza di circa 1 mm) è poi spustatu longu u tubu per valutà l'effettu di a forza di u campu è a pusizione.
Un setup di imaging in vitro chì cuntene campioni MP in capillari di vetru in u stadiu di traduzzione di u sample xy.U percorsu di u fasciu di raghji X hè marcatu cù una linea di punti rossi.
Una volta chì a visibilità in vitro di i MP hè stata stabilita, un sottogruppu di elli hè statu pruvatu in vivo nantu à ratti albini Wistar di tipu salvaticu (~ 12 settimane, ~ 200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Giappone), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Giappone) è butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).I ratti sò stati anestetizzati cù una mistura Pharma (Giappone) per iniezione intraperitoneale.Dopu l'anesthesia, sò stati preparati per l'imaghjini sguassendu a pelle intornu à a trachea, inserisce un tubu endotracheale (ET; 16 Ga cannula intravenosa, Terumo BCT), è immobilizendu in a pusizione supina nantu à una piastra d'imaghjini apposta chì cuntene un saccu termale. per mantene a temperatura di u corpu.22. U pianu di l'imaghjini hè stata attaccata à u palcuscenicu di mostra in a scatula di l'imaghjini à un ligeru angulu per allineà a trachea horizontalmente nantu à l'imaghjini di raghji X cum'è mostra in Figura 2a.
(a) Configurazione di l'imaghjini in vivo in l'unità di imaging SPring-8, u percorsu di u fasciu di raghji X marcatu cù una linea punteggiata rossa.(b, c) A localizzazione di magneti tracheali hè stata realizata remotamente utilizendu duie camere IP montate ortogonalmente.À u latu manca di l'imaghjini nantu à u screnu, pudete vede u ciclu di filu chì tene a testa è a cannula di consegna installata in u tubu ET.
Un sistema di pompa di siringa cuntrullata à distanza (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) cù una siringa di vetru 100 µl hè stata cunnessa à un tubu PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) cù una agulla 30 Ga.Marca u tubu per assicurà chì a punta hè in a pusizione curretta in a trachea quandu inserisce u tubu endotracheal.Utilizendu una micropump, u pistone di a siringa hè stata eliminata è a punta di u tubu hè stata immersa in a mostra MP per esse mandata.U tubu di consegna caricatu hè statu inseritu in u tubu endotracheale, pusendu a punta à a parte più forte di u nostru campu magneticu applicatu previstu.L'acquisizione di l'imaghjini hè stata cuntrullata cù un detector di respirazione cunnessu à a nostra scatula di timing basatu in Arduino, è tutti i segnali (per esempiu, temperatura, respirazione, otturatore apertu / chjusu, è acquisizione di l'imaghjini) sò stati registrati cù Powerlab è LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Quandu Imaging Quandu l'alloghju ùn era micca dispunibule, duie camere IP (Panasonic BB-SC382) sò state posizionate à circa 90 ° l'una di l'altru è usate per cuntrullà a pusizione di u magnetu relative à a trachea durante l'imaghjini (Figura 2b, c).Per minimizzà l'artefatti di u muvimentu, una maghjina per respira hè stata acquistata durante u pianu di u flussu respiratoriu terminal.
U magnetu hè attaccatu à a seconda tappa, chì pò esse situatu remotamente à l'esternu di u corpu di l'imaghjini.Diversi pusizioni è cunfigurazioni di u magnetu sò stati pruvati, cumpresi: pusatu à un angolo di circa 30 ° sopra a trachea (i cunfigurazioni sò mostrati in Figuri 2a è 3a);un magnetu sopra à l'animali è l'altru sottu, cù i poli setti per l'attrazione (Figura 3b)., un magnetu sopra à l'animali è unu sottu, cù i poli setti per a repulsione (Figura 3c), è un magnetu sopra è perpendiculare à a trachea (Figura 3d).Après avoir installé l'animal et l'aimant et chargé le MP à l'essai dans la pompe à seringue, délivrer une dose de 50 µl à une vitesse de 4 µl/s lors de l'acquisition d'images.U magnetu hè poi spustatu avanti è avanti longu o attraversu a trachea mentre cuntinueghja à acquistà l'imaghjini.
Cunfigurazione di magnetu per l'imaghjini in vivo (a) un magnetu sopra a trachea à un angolo di circa 30 °, (b) dui magneti cunfigurati per l'attrazione, (c) dui magneti cunfigurati per a repulsione, (d) un magnetu sopra è perpendiculare à u trachea.L'osservatore hà guardatu da a bocca à i pulmoni attraversu a trachea è u fasciu di raghji X passava per u latu manca di u ratu è esce da u latu drittu.U magnetu hè o movendu longu à a longa di a via aerea o à manca è ghjustu sopra a trachea in a direzzione di u fasciu di raghji X.
Avemu ancu cercatu di determinà a visibilità è u cumpurtamentu di e particelle in e vie aeree in l'absenza di mischjà a respirazione è a freccia cardiaca.Dunque, à a fine di u periodu di l'imaghjini, l'animali sò stati eutanasiati per via di una sobredose di pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Certi animali sò stati lasciati nantu à a piattaforma di l'imaghjini, è dopu a cessazione di a respirazione è u battu di u core, u prucessu di l'imaghjini hè stata ripetuta, aghjunghjendu una dosa supplementu di MP si ùn MP era visibile nantu à a superficia di a via aerea.
L'imaghjini risultanti sò stati curretti per u campu pianu è scuru è poi assemblati in un filmu (20 frames per seconda; 15-25 × velocità normale secondu a freccia di respirazione) utilizendu un script persunalizatu scrittu in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tutti i studii nantu à a consegna di vettori di u genu LV sò stati realizati in u Centru di Ricerca Animali di Laboratoriu di l'Università di Adelaide è anu destinatu à utilizà i risultati di l'esperimentu SPring-8 per valutà se a consegna LV-MP in presenza di un campu magneticu puderia rinfurzà u trasferimentu di geni in vivo. .Per evaluà l'effetti di MF è u campu magneticu, dui gruppi di animali sò stati trattati: un gruppu hè stata injected with LV MF with magnet placement, è l'altru gruppu hè stata injected cun un gruppu di cuntrollu cù LV MF senza magnet.
I vettori di u genu LV sò stati generati cù i metudi descritti prima 25, 26.U vettore LacZ esprime un genu di beta-galactosidase localizatu nucleari guidatu da u promotore custitutivu MPSV (LV-LacZ), chì produce un pruduttu di reazzione blu in e cellule trasdutte, visibili in fronti è sezzioni di u tissutu pulmonariu.A titration hè stata realizata in i culturi di cellule cuntendu manualmente u numeru di cellule LacZ-positive cù un hemocitometru per calculà u titulu in TU / ml.I trasportatori sò criopreservati à -80 ° C, scongelati prima di l'usu, è ligati à CombiMag mischjendu 1: 1 è incubate nantu à ghiaccio per almenu 30 minuti prima di a consegna.
Ratti normali Sprague Dawley (n = 3 / gruppu, ~ 2-3 anestetizzati ip cù una mistura di 0,4 mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) è 60 mg / kg ketamina (Ilium, Australia) à 1 mese di età) ip ) iniezione è cannulazione orale non chirurgica cù una cannula intravenosa 16 Ga.Per assicurà chì u tessulu tracheale riceve trasduzione LV, hè statu cundizionatu cù u nostru protocolu di perturbazione meccanica descritta prima in quale a superficia tracheale hè stata strofinata assialmente cù una cesta di filu (N-Circle, extractor di pietra di nitinol senza punta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Dopu, circa 10 minuti dopu a perturbazione in u cabinet di biosegurità, l'amministrazione tracheale di LV-MP hè stata realizata.
U campu magneticu utilizatu in questu esperimentu hè stata cunfigurata in modu simile à un studiu di raghji X in vivo, cù i stessi magneti tenuti nantu à a trachea cù stent clamps di distillazione (Figura 4).Un volume di 50 µl (2 x 25 µl aliquote) di LV-MP è stato consegnato alla trachea (n = 3 animali) usando una pipetta a punta di gel come descritto precedentemente.U gruppu di cuntrollu (n = 3 animali) hà ricevutu u stessu LV-MP senza l'usu di un magnetu.Dopu à a fine di l'infuzione, a cannula hè eliminata da u tubu endotracheal è l'animali hè extubated.U magnetu ferma in u locu per 10 minuti prima di esse cacciatu.I ratti sò stati dosati subcutaneously cù meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) seguitu da a retirazzione di l'anesthesia per iniezione intraperitoneale di 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).I rati sò stati mantenuti caldi è osservati finu à a ricuperazione completa da l'anesthesia.
Dispositivo di consegna LV-MP in un armadiu di sicurezza biologica.Pudete vede chì a manica di luer-lock grisgiu chjaru di u tubu ET protrudes da a bocca, è a punta di pipette di gel mostrata in a figura hè inserita à traversu u tubu ET à a prufundità desiderata in a trachea.
Una settimana dopu à a prucedura di amministrazione LV-MP, l'animali sò stati sacrificati umanamente per inalazione di 100% CO2 è l'espressione LacZ hè stata valutata cù u nostru trattamentu standard X-gal.I trè anelli di cartilagine più caudali sò stati eliminati per assicurà chì qualsiasi dannu meccanicu o ritenzione di fluidu per via di a piazza di u tubu endotracheale ùn saria micca inclusu in l'analisi.Ogni trachea hè stata tagliata longitudinalmente per ottene duie metà per l'analisi è posta in una tazza chì cuntene gomma di silicone (Sylgard, Dow Inc) cù una agulla Minutien (Fine Science Tools) per visualizà a superficia luminale.A distribuzione è u caratteru di e cellule trasdutte sò stati cunfirmati da a fotografia frontale utilizendu un microscopiu Nikon (SMZ1500) cù una camera DigiLite è u software TCapture (Tucsen Photonics, China).L'imaghjini sò stati acquistati à l'ingrandimentu 20x (cumpresu u paràmetru massimu per a larghezza completa di a trachea), cù tutta a lunghezza di a trachea affissata passu per passu, chì furnisce abbastanza sovrapposizione trà ogni imagine per permette à l'imaghjini di esse "cuciti".L'imaghjini da ogni trachea sò stati cumminati in una sola maghjina cumposta utilizendu a versione 2.0.3 di Composite Image Editor (Microsoft Research) aduprendu l'algoritmu di muvimentu planar. L'area di l'espressione di LacZ in l'imaghjini composti tracheali da ogni animale hè stata quantificata utilizendu un script MATLAB automatizatu (R2020a, MathWorks) cum'è descrittu prima28, utilizendu paràmetri di 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, è Value <0.7. L'area di l'espressione LacZ in l'imaghjini composti tracheali da ogni animale hè stata quantificata utilizendu un script MATLAB automatizatu (R2020a, MathWorks) cum'è descrittu prima28, utilizendu paràmetri di 0.35 < Hue < 0.58, Saturation> 0.15, è Value < 0.7. Площ_TAD OSэксси с Lacz в听 трех ПОстаженияхиееи оо идогогпольчотизиекаматия жиеанарнагт свылазотизиекаматия жиенаратизиеTонатизиеенатизиекамтизиеоматия Grans , Mathworks), как описно ране28, исльем настроек 0,35 <оттенок <0,58, НасыOSCOть> 0,15 иначение <0 ,7. L'area di l'espressione di LacZ in l'imaghjini tracheali composti da ogni animale hè stata quantificata utilizendu un script MATLAB automatizatu (R2020a, MathWorks) cum'è descrittu prima28 utilizendu paràmetri di 0.35.0,15 è valore <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复的尔管复合帀复合帀复合 Lac进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 的 的 管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Облести экспресии lacиage lacaВнстаженияхобочтли с жиемнат веноаого тноматия жфенаротизиематия Aclay, Mat HamSta, Mathegeda, Mathegeda, Mathwons, Mathissi, Mathwons, Mathege, Mathwons, Math20a, Mathwons, Mathebshions) , как Описано ранеее, ислем Настроек 0,35 <оттенок <0,58, НасыOSнасть> 0,15 и значение <0,1 . I zoni di espressione LacZ nantu à l'imaghjini cumposti di a trachea di ogni animali sò stati quantificati utilizendu un script MATLAB automatizatu (R2020a, MathWorks) cum'è descrittu prima utilizendu paràmetri di 0.35 < tonalità < 0.58, saturazione> 0.15 è valore < 0.7 .Tracendu i contorni di tissuti in GIMP v2.10.24, una maschera hè stata creata manualmente per ogni imagine composta per identificà l'area di tissuti è impedisce qualsiasi falsi rilevazioni fora di u tissutu tracheale.I zoni macchiati da tutte l'imaghjini cumposti da ogni animali sò stati sommati per dà l'area macchiata tutale per quellu animale.L'area dipinta hè stata poi divisa da l'area tutale di a maschera per ottene una zona normalizzata.
Ogni trachea hè stata inclusa in paraffina è sezionata 5 µm di spessore.E rùbbriche sò state cuntrastate cù rossu neutru veloce per 5 minuti è l'imaghjini sò stati acquistati cù un microscopiu Nikon Eclipse E400, camera DS-Fi3 è software di cattura di elementi NIS (versione 5.20.00).
Tutte l'analisi statistiche sò state realizate in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).A significazione statistica hè stata stabilita à p ≤ 0,05.A nurmalità hè stata pruvata utilizendu a prova Shapiro-Wilk è e differenze in a tintura di LacZ sò state valutate cù un test t senza pari.
I sei MP descritti in a Tabella 1 sò stati esaminati da PCXI, è a visibilità hè scritta in a Tabella 2. Dui MP di polistirene (MP1 è MP2; 18 µm è 0,25 µm, rispettivamente) ùn eranu micca visibili da PCXI, ma i mostri rimanenti puderanu esse identificati. (esempii sò mostrati in Figura 5).MP3 è MP4 sò debbuli visibili (10-15% Fe3O4; 0,25 µm è 0,9 µm, rispettivamente).Bien que MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contienne certaines des plus petites particules testées, il était le plus prononcé.U pruduttu CombiMag MP6 hè difficiule di distingue.In tutti i casi, a nostra capacità di detectà MFs hè stata assai migliurata movendu u magnetu avanti è avanti in parallelu à u capillare.Quandu i magneti si alluntananu da u capillare, e particelle sò state tirate fora in catene longu, ma cum'è i magneti s'avvicinavanu è a forza di u campu magneticu aumentava, e catene di particelle si scurciavanu mentre e particelle migravanu versu a superficia superiore di u capillare (vede u Video Supplemental S1). : MP4), aumentendu a densità di particella à a superficia.À u cuntrariu, quandu u magnetu hè sguassatu da u capillare, a forza di u campu diminuisce è i MP riarranganu in catene longu chì si estendenu da a superficia superiore di u capillare (vede Video Supplementary S2: MP4).Dopu chì u magnetu smette di muvimenti, i particeddi cuntinueghjanu à muvimenti per qualchì tempu dopu avè righjuntu a pusizione di equilibriu.Quandu u MP s'avvicina è alluntanassi da a superficia superiore di u capillare, i particeddi magnetichi tendenu à attirà i detriti attraversu u liquidu.
A visibilità di MP sottu PCXI varieghja considerablemente trà i campioni.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 è (d) MP6.Tutte l'imaghjini mostrati quì sò stati pigliati cù un magnetu posizionatu à circa 10 mm direttamente sopra à u capillare.L'apparenti grandi circles sò bolle d'aria intrappulati in i capillari, chì mostranu chjaramente e caratteristiche di u bordu biancu è biancu di l'imaghjini di cuntrastu di fasi.A casella rossa indica l'ingrandimentu chì aumenta u cuntrastu.Nota chì i diametri di i circuiti magnetichi in tutti i figuri ùn sò micca à scala è sò circa 100 volte più grande di ciò chì mostra.
Cum'è u magnetu si move à manca è à destra à u cima di u capillare, l'angolo di a corda MP cambia per allineà cù u magnetu (vede a figura 6), delineendu cusì e linee di u campu magneticu.Per MP3-5, dopu chì l'accordu righjunghji l'angolo di u limitu, i particeddi trascinanu longu a superficia superiore di u capillare.Stu risultatu spessu in MPs clustering in gruppi più grande vicinu à induve u campu magneticu hè più forte (vede Supplementary Video S3: MP5).Questu hè ancu soprattuttu evidenti quandu l'imaghjini vicinu à a fine di u capillare, chì face chì u MP aggregate è cuncentrazione à l'interfaccia liquid-air.I particeddi in u MP6, chì eranu più difficiuli di distinguiri cà quelli chì in u MP3-5, ùn trascinò quandu u magnetu spustatu longu u capillary, ma i fili MP dissociated, lassannu i particeddi in vista (vede Supplementary Video S4: MP6).In certi casi, quandu u campu magneticu appiicatu hè stata ridutta movendu u magnetu à una longa distanza da u situ di l'imaghjini, qualsiasi MPs restante scende lentamente à a superficia di u tubu per gravità, restanu in a corda (vede Video Supplementary S5: MP3). .
L'angolo di a corda MP cambia cum'è u magnetu si move à a diritta sopra à u capillare.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 è (d) MP6.A casella rossa indica l'ingrandimentu chì aumenta u cuntrastu.Per piacè nutate chì i video supplementari sò per scopi informativi, postu chì revelanu una struttura di particella impurtante è infurmazione dinamica chì ùn pò micca esse visualizata in queste immagini statiche.
I nostri testi anu dimustratu chì u muvimentu di u magnetu avanti è avanti lentamente longu a trachea facilita a visualizazione di u MF in u cuntestu di u muvimentu cumplessu in vivo.Nisuna prova in vivo hè stata realizata perchè e perle di polistirene (MP1 è MP2) ùn eranu micca visibili in u capillare.Chacun des quatre MF restants a été testé in vivo avec l'axe long de l'aimant positionné sur la trachée à un angle d'environ 30° par rapport à la verticale (voir les figures 2b et 3a), car il en résultait des chaînes MF plus longues et était plus efficace. chè un magnetu..cunfigurazione finita.MP3, MP4 è MP6 ùn sò micca stati truvati in a trachea di qualsiasi animali vivi.Quandu si vede u trattu respiratoriu di i rati dopu à uccidendu umanamente l'animali, e particelle restavanu invisibili ancu quandu u voluminu supplementu hè statu aghjuntu cù una pompa di siringa.MP5 hà avutu u più altu cuntenutu di l'ossidu di ferru è era l'unica particella visibile, cusì hè stata utilizata per valutà è caratterizà u cumpurtamentu MP in vivo.
A piazzamentu di u magnetu nantu à a trachea durante l'inserzione di MF hà risultatu in parechji, ma micca tutti, MFs cuncentrati in u campu di vista.L'entrata tracheale di particelle hè megliu osservata in animali eutanasiati umanamente.Figura 7 è Video Supplementary S6: MP5 mostra a cattura magnetica rapida è l'allineamentu di particeddi nantu à a superficia di a trachea ventrale, chì indica chì i MP ponu esse destinati à e zone desiderate di a trachea.Quandu si cercanu più distalmente longu a trachea dopu a consegna di MF, alcuni MF sò stati trovati più vicinu à a carina, chì indica una forza di campu magneticu insufficiente per cullà è mantene tutti i MF, postu chì sò stati mandati à traversu a regione di forza massima di u campu magneticu durante l'amministrazione fluida.prucessu.In ogni casu, i cuncintrazioni di MP postnatali eranu più altu intornu à l'area di l'imaghjini, chì suggerenu chì parechji MP sò stati in e regioni di a via aerea induve a forza di u campu magneticu applicatu era più altu.
L'imaghjini di (a) prima è (b) dopu a consegna di MP5 in a trachea di un ratu recentemente eutanasiatu cù un magnetu situatu ghjustu sopra l'area di imaging.L'area illustrata hè situata trà dui anelli cartilaginosi.Ci hè un pocu di fluidu in e vie aeree prima chì u MP hè mandatu.A casella rossa indica l'ingrandimentu chì aumenta u cuntrastu.Sti images sò pigliati da u video prisentatu in S6: MP5 Supplementary Video.
Moving the magnet along the trachea in vivo resulted in a change in the angle of the MP chain on the airway surface, similar to that observed in capillaries (vede Figure 8 and Supplementary Video S7: MP5).Tuttavia, in u nostru studiu, MP ùn pudia esse trascinatu longu a superficia di tracts respiratorii viventi, cum'è capillaries pudia fà.In certi casi, a catena MP allunga cum'è u magnete si move à manca è à diritta.Curiosamente, avemu ancu truvatu chì a catena di particella cambia a prufundità di a superficia di u fluidu quandu u magnetu hè mossa longitudinalmente longu a trachea, è si dilata quandu u magnetu hè spustatu direttamente sopra è a catena di particella hè rotata à una pusizione verticale (vede. Video supplementari S7).: MP5 à 0:09, in fondu à destra).U mudellu di muvimentu caratteristicu hà cambiatu quandu u magnetu hè stata mossa lateralmente à traversu a cima di a trachea (vale à dì, à a manca o à a diritta di l'animali, invece di a longu di a trachea).I particeddi eranu sempre chjaramente visibili durante u so muvimentu, ma quandu u magnetu hè statu sguassatu da a trachea, i punte di e corde di particella sò diventate visibili (vede Supplementary Video S8: MP5, partendu da 0:08).Questu accunsenu cù u cumpurtamentu osservatu di u campu magneticu sottu l'azzione di un campu magneticu applicatu in un capillare di vetru.
Imàgini di mostra chì mostranu MP5 in a trachea di un ratu anestesiatu vivu.(a) U magnetu hè utilizatu per acquistà l'imaghjini sopra è à manca di a trachea, dopu (b) dopu avè spustatu u magnetu à a diritta.A casella rossa indica l'ingrandimentu chì aumenta u cuntrastu.Sti images sò da u video prisentatu in S7's Supplementary Video: MP5.
Quandu i dui poli sò stati sintonizzati in una orientazione nordu-sud sopra è sottu à a trachea (vale à dì, attraente; Fig. 3b), i cordi MP parevanu più longu è sò stati situati nantu à u muru laterale di a trachea in quantu à a superficia dorsale di u trachea. trachea (vede l'Appendice).Video S9: MP5).In ogni casu, alta concentrazione di particeddi in un situ (vale à dì, a superficia dorsale di a trachea) ùn sò micca stati rilevati dopu l'amministrazione di fluidu cù un dispositivu magnetu duale, chì generalmente si trova cù un dispositivu magnetu unicu.Dopu, quandu un magnetu hè stata cunfigurata per respinge i poli opposti (Figura 3c), u numeru di particelle visibili in u campu di vista ùn hà micca aumentatu dopu a consegna.L'installazione di e duie cunfigurazioni magnetichi hè una sfida per via di l'alta forza di u campu magneticu chì attrae o spinge i magneti rispettivamente.A cunfigurazione hè stata cambiata à un unicu magnetu parallelu à e vie aeree, ma chì passava per e vie aeree in un angolo di 90 gradi per chì e linee di forza attraversà u muru tracheale ortogonalmente (Figura 3d), una orientazione destinata à determinà a pussibilità di aggregazione di particelle nantu u muru laterale.esse osservatu.Tuttavia, in questa cunfigurazione, ùn ci era micca un muvimentu d'accumulazione MF identificabile o un muvimentu magnetu.Basatu nantu à tutti questi risultati, una cunfigurazione cù un magnetu unicu è una orientazione di 30 gradi hè stata scelta per studii in vivo di i trasportatori di geni (Fig. 3a).
Quandu l'animali hè statu imaginatu parechje volte immediatamente dopu esse sacrificatu umanamente, l'absenza di u muvimentu di i tissuti interferenti significava chì e linee di particelle più fini è più brevi puderanu esse discerne in u campu intercartilaginous chjaru, "swinging" in cunfurmità cù u muvimentu di traduzzione di u magnete.vede chjaramente a prisenza è u muvimentu di particeddi MP6.
U titulu di LV-LacZ era 1,8 x 108 UI/mL, è dopu a mistura 1:1 cù CombiMag MP (MP6), l'animali sò stati iniettati cù 50 µl di una dose tracheale di 9 x 107 IU/ml di veiculu LV (vale à dì 4,5). x 106 TU/rat).).).In questi studii, invece di spustà u magnetu durante u travagliu, avemu fissatu u magnetu in una pusizioni per determinà se a trasduzione LV puderia (a) esse migliurata in paragunà à a consegna di vettore in l'absenza di un campu magneticu, è (b) se a via aerea puderia. esse concentratu.E cellule sò trasdutte in e zone di destinazione magnetiche di e vie respiratorie superiore.
A prisenza di magneti è l'usu di CombiMag in cumminazione cù vettori LV ùn parevanu micca affettà negativamente a salute di l'animali, cum'è u nostru protocolu standard di consegna di vettore LV.L'imaghjini frontali di a regione tracheale sottumessu à a perturbazione meccanica (Figura Supplementaria 1) hà dimustratu chì u gruppu trattatu LV-MP avia livelli significativamente più altu di trasduzzione in presenza di un magnetu (Fig. 9a).Solu una piccula quantità di colorazione blu LacZ era presente in u gruppu di cuntrollu (Figura 9b).A quantificazione di e regioni normalizate X-Gal-stained hà dimustratu chì l'amministrazione di LV-MP in a presenza di un campu magneticu hà risultatu in una mellura di circa 6 volte (Fig. 9c).
Esempiu d'imaghjini cumposti chì mostranu a trasduzione tracheale cù LV-MP (a) in presenza di un campu magneticu è (b) in assenza di un magnete.(c) Migliuranza statisticamente significativa in l'area normalizzata di trasduzione LacZ in a trachea cù l'usu di un magnetu (* p = 0.029, t-test, n = 3 per gruppu, media ± errore standard di a media).
Sezioni neutrali di rossu rossu veloce (esempiu mostratu in Supplementary Fig. 2) indicanu chì i celluli di LacZ-stained eranu prisenti in u stessu campionu è in u stessu locu cum'è infurmatu prima.
A sfida chjave in a terapia genica di e vie aeree resta a localizazione precisa di e particelle di trasportu in i zoni d'interessu è a rializazione di un altu livellu di efficienza di trasduzione in u pulmone mobile in presenza di flussu d'aria è clearance mucus attivu.Per i trasportatori di LV destinati à u trattamentu di e malatie respiratorie in fibrosi cistica, l'aumentu di u tempu di residenza di e particelle di u trasportatore in e vie aeree conductive hè statu finu à quì un scopu inaccessibile.Comu indicatu da Castellani et al., L'usu di campi magnetichi per rinfurzà a trasduzione hà vantaghji nantu à altri metudi di consegna di geni cum'è l'elettroporazione perchè pò unisce simplicità, ecunumia, consegna localizzata, efficienza aumentata è tempu d'incubazione più brevi.è possibbilmente una dosa più bassa di veiculu10.Tuttavia, a deposizione in vivo è u cumpurtamentu di particeddi magnetichi in e vie aeree sottu à l'influenza di e forze magnetiche esterne ùn sò mai state descritte, è in fattu a capacità di stu metudu per aumentà i livelli di espressione genica in e vie aeree viventi intactu ùn hè micca statu dimustratu in vivo.
I nostri esperimenti in vitro nantu à u sincrotronu PCXI anu dimustratu chì tutte e particelle chì avemu pruvatu, cù l'eccezzioni di u polistirene MP, eranu visibili in a configurazione di l'imaghjini chì avemu usatu.In a prisenza di un campu magneticu, i campi magnetichi formanu strings, a durata di quale hè ligata à u tipu di particeddi è a forza di u campu magneticu (ie, a vicinanza è u muvimentu di u magnetu).Comu mostra in a Figura 10, e corde chì avemu osservatu sò furmate cum'è ogni particella individuale diventa magnetizzata è induce u so propiu campu magneticu lucale.Questi campi separati causanu altre particeddi simili per cullà è cunnetta cù movimenti di corda di gruppu per via di e forze lucali da e forze lucali di attrazione è repulsione di altre particelle.
Diagramma chì mostra (a, b) catene di particelle chì si formanu in i capillari pieni di fluidu è (c, d) una trachea piena d'aria.Nota chì i capillari è a trachea ùn sò micca disegnati à scala.U pannellu (a) cuntene ancu una descrizzione di u MF chì cuntene particelle Fe3O4 disposte in catene.
Quandu u magnetu si trasfirìu nantu à u capillare, l'angulu di a stringa di particella hà righjuntu u limitu criticu per MP3-5 chì cuntene Fe3O4, dopu chì a stringa di particella ùn resta più in a so pusizioni originale, ma si move nantu à a superficia à una nova pusizione.magnetu.Stu effettu prubabilmente accade perchè a superficia di u capillare di vetru hè abbastanza liscia per permette stu muvimentu.Curiosamente, MP6 (CombiMag) ùn si cumportanu micca cusì, forse perchè e particeddi eranu più chjuchi, avianu un revestimentu sfarente o carica di superficia, o u fluidu di u trasportatore propiu hà affettatu a so capacità di muvimentu.U cuntrastu in l'imaghjini di particelle CombiMag hè ancu più debule, chì suggerenu chì u liquidu è e particelle ponu avè a listessa densità è per quessa ùn ponu micca facilmente spustà versu l'altru.E particelle ponu ancu appiccicate se u magnetu si move troppu veloce, chì indica chì a forza di u campu magneticu ùn pò micca sempre superà l'attrito trà e particelle in u fluidu, chì suggerenu chì a forza di u campu magneticu è a distanza trà u magnetu è l'area di destinazione ùn deve esse micca sorpresa.impurtante.Questi risultati indicanu ancu chì, ancu s'è i magneti ponu catturà parechje microparticelle chì scorri per l'area di destinazione, hè improbabile chì i magneti ponu esse affidati per spustà e particelle CombiMag longu a superficia di a trachea.Cusì, avemu cunclusu chì i studii in vivo LV MF duveranu aduprà campi magnetichi statichi per destinà fisicamente à e zone specifiche di l'arbulu di a via aerea.
Una volta chì i particeddi sò mandati in u corpu, sò difficiuli di identificà in u cuntestu di u tessulu cumplessu in muvimentu di u corpu, ma a so capacità di deteczione hè stata migliurata movendu u magnetu horizontale nantu à a trachea per "move" e corde MP.Mentre chì l'imaghjini in tempu reale hè pussibule, hè più faciule per discernisce u muvimentu di particelle dopu chì l'animali hè statu umanu uccisu.A cuncentrazione di MP era di solitu più altu in questu locu quandu u magnetu era posizionatu sopra l'area di l'imaghjini, ancu s'è alcune particelle sò generalmente truvate più in trachea.A cuntrariu di i studii in vitro, e particelle ùn ponu esse trascinate in a trachea da u muvimentu di un magnetu.Questa scuperta hè coherente cù a manera chì u mucus chì copre a superficia di a trachea tipicamente processa e particelle inalate, intrappulà in u mucu è dopu li sbulicà attraversu u mecanismu di clearance muco-ciliare.
Avemu l'ipotesi chì l'usu di i magneti sopra è sottu à a trachea per l'attrazione (Fig. 3b) puderia esse risultatu in un campu magneticu più uniforme, invece di un campu magneticu chì hè assai cuncentratu in un puntu, potenzalmentu risultatu in una distribuzione più uniforme di particeddi..Tuttavia, u nostru studiu preliminariu ùn hà micca truvatu evidenza chjara per sustene sta ipotesi.In u listessu modu, stabilisce un paru di magneti à repulse (Fig. 3c) ùn hà micca risultatu in più particella chì si stalla in a zona di l'imaghjini.Sti dui scuperti dimustranu chì a setup dual-magnet ùn migliurà significativamente u cuntrollu lucale di MP pointing, è chì e forze magnetichi forti risultanti sò difficiuli di sintonizà, facendu stu approcciu menu praticu.In listessu modu, l'orientazione di u magnetu sopra è attraversu a trachea (Figura 3d) ùn hà ancu aumentatu u nùmeru di particeddi chì restanu in l'area di l'imaghjini.Alcune di queste cunfigurazioni alternative ùn ponu micca successu, perchè risultatu in una riduzione di a forza di u campu magneticu in a zona di deposizione.Cusì, a cunfigurazione di magnetu unicu à 30 gradi (Fig. 3a) hè cunsideratu u metudu di teste in vivo più simplice è efficaci.
U studiu LV-MP hà dimustratu chì quandu i vettori LV sò stati cumminati cù CombiMag è consegnati dopu esse disturbati fisicamente in a presenza di un campu magneticu, i livelli di trasduzzione aumentanu significativamente in a trachea cumparatu cù i cuntrolli.Basatu nantu à studi imaging synchrotron è risultati LacZ, u campu magneticu paria à esse in gradu di tene u LV in la trachea è riduce u numeru di particeddi vettore chì subitu penetratu prufonda in u pulmone.Tali miglioramenti di targeting ponu purtà à una efficienza più altu mentre riduce i titri consegnati, a trasduzione non mirata, l'effetti secundari infiammatori è immune, è i costi di trasferimentu di geni.Impurtante, sicondu u fabricatore, CombiMag pò esse usatu in cumminazione cù altri metudi di trasferimentu di geni, cumpresi altri vettori virali (cum'è AAV) è acidi nucleici.