Giardia duodenum hè un urganismu parasitariu chì provoca giardiasis, una infizzione intestinali particularmente cumuni in i zitelli cù signali clinichi di diarrea.Avemu infurmatu prima chì G. duodenalis extracellulare attiva l'attivazione di u receptore intracellulare di oligomerization-like 3 (NLRP3) nucleotidi di ubligatoriu è regula risposti inflammatory host through extracellular vesicle (EV) secretion.Tuttavia, i mudelli moleculari precisi di u duodenococcal EV (GEV) assuciatu à i patogeni implicati in stu prucessu è u rolu di l'inflammasome NLRP3 in a giardiasi restanu da esse elucidati.
I plasmidi di espressione eucariotica recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 è alfa-7.3 giardins in GEV sò stati custruiti, trasfettati in macrofagi peritoneali primari di u mouse, è rilevati da a misura di a molecula di destinazione di inflammazione caspase-1.U nivellu di espressione p20 hè statu screened..G. duodenalis alpha-2 è alpha-7.3 giardines sò stati urigginariamenti identificati da a misurazione di NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 è caspase-1 p20), secrezione di IL.1β, livelli di oligomerizzazione di proteina macchiata apoptotica (ASC) e localizzazione immunofluorescente di NLRP3 e ASC.U rolu di l'inflammasome NLRP3 in a patogenicità di G. duodenalis hè stata poi valutata cù i surci in i quali l'attivazione di NLRP3 hè stata bluccata (NLRP3 bluccatu surci) è i cambiamenti patologichi in u pesu di u corpu, a carica parasitica duodenale è u tessulu duodenali sò stati monitorati.Inoltre, avemu investigatu se hiardines alpha-2 è alpha-7.3 induce a secrezione di IL-1β in vivo via l'inflammasome NLRP3 è determinatu u rolu di sti moléculi in a patogenicità di G. duodenalis in i topi.
L'alfa-2 è l'alfa-7.3 giardine induiscenu l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 in vitro.Questu hà purtatu à l'attivazione di p20 caspase-1, un aumentu di i livelli d'espressione di e proteine ​​​​NLRP3, pro-IL-1β è pro-caspase-1, un aumentu significativu di a secrezione di IL-1β, a furmazione di spots ASA in u citoplasma, è l'induzione di l'oligomerizazione ASA.Inflamazioni NLRP3 A perdita di u pene aggrava a patogenicità di G. duodenalis in i topi.I topi trattati cù cisti da gavage da topi bloccati da NLRP3 presentavanu un numeru aumentatu di trofozoiti è danni severi à i villi duodenali, carattarizati da cripte necrotiche cù scontri è ramificati.L'esperimenti in vivo anu dimustratu chì i giardines alpha-2 è alpha-7.3 ponu induce a secrezione di IL-1β via l'inflammasome NLRP3, è l'immunizazione cù giardines alpha-2 è alpha-7.3 reduciu a patogenicità di G. duodenalis in i topi.
Inseme, i risultati di stu studiu suggerenu chì giardia alpha-2 è alpha-7.3 causanu upregulation of host NLRP3 inflammation and reduce the infectivity of G. duodenalis in surci, chì sò promettenti miri per prevenzione di giardiasis.
Giardia duodenum hè un parasite protozoicu extracellulare chì vive in l'intestinu chjucu è causa 280 milioni di casi di giardiasi cù diarrea annu, in particulare trà i zitelli in i paesi in via di sviluppu [1].E persone sò infettate da l'acqua potabile o l'alimentu cuntaminatu da M. duodenum cysts, chì poi entra in u stomacu è sò excreted in i succhi gastri.I trofozoiti di Giardia duodenum si attaccanu à l'epiteliu duodenale, causannu nausea, vomitu, diarrea, dolore abdominal è perdita di pisu.L'individui cù immunodeficienza è fibrosi cistica sò suscettibili à l'infezzione.L'infezzione pò ancu accade per u sessu orale è anale [2].Drogi cum'è metronidazole, tinidazole è nitazoxanide sò l'opzioni di trattamentu preferite per l'infezioni duodenali [3].Tuttavia, sti droghe di chimioterapia causanu effetti secundari avversi, cum'è nausea, carcinogenesi è genotossicità [4].Per quessa, strategie più efficau deve esse sviluppatu per prevene l'infezzione da G. duodenalis.
Inflammasomi sò una classa di cumplessi di proteine ​​​​citosoliche chì facenu parte di a risposta immune innata, aiutendu à difende contr'à l'invasione di patogeni è mediate risposti inflammatorii [5].Trà questi inflammasomi, l'oligomerizazione di nucleotide-binding (NOD) receptore 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) inflammasome nucleotide-binding-like inflammasome hè statu ampiamente studiatu perchè pò esse rilevatu da diversi mudelli moleculari associati à patogeni / danni (PAMP/). DAMP), ricunnosce, attiva u sistema immune innate.è regula l'omeostasi intestinali in parechje malatie inflammatorii [6,7,8].Hè custituitu da u receptore di ricunniscenza di u mudellu (PRR) NLRP3, una proteina maculata apoptotica adattatore (ASC), è un effector procaspase-1 o procaspase-11.L'inflammasome NLRP3 agisce cum'è un òspite contr'à l'invasione di patogeni, cum'è osservatu in Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], è studii di Leishmania.[11], ma hè statu ancu infurmatu chì l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 limita i risposti immune protettivi è aggrava a progressione di a malatia, per esempiu, in i vermi [12].Basatu nantu à i nostri scuperti previ, avemu infurmatu chì G. duodenalis extracellulare attiva l'attivazione intracellulare di l'inflamazioni NLRP3 è modula i risposti inflammatorii di l'ospiti secreendu vesiculi extracellulari (EVs) [13].In ogni casu, u rolu di l'inflammasome NLRP3 in l'infezzione di G. duodenalis in vivo resta per esse determinatu.
Giardins eranu urigginariamenti discrittu cum'è cumpunenti strutturale di u cytoskeleton G. duodenalis è ghjucà un rolu impurtante in a motilità trophozoite è l'attaccamentu di e cellule epiteliali in u intestinu chjucu.Per adattà megliu à l'ambienti è aumentà a so patogenicità, i trofozoiti di G. duodenalis anu sviluppatu una struttura citoscheletale unica chì si compone di 8 flagella, 1 corpu mediu è 1 disc ventrale [14].I trofozoiti di Giardia duodenu utilizanu u so citoscheletru per penetrà in l'intestinu chjucu superiore, in particulare u duodenu, è attache à l'enterociti.Migranu constantemente è si attaccanu à e cellule epiteliali cù u metabolismu cellulare.Dunque, ci hè una stretta relazione trà u so citoscheletru è a virulenza.Giardini specifichi per Giardia duodenum sò cumpunenti di a struttura di cytoskeleton [15] è sò divisi in quattru classi: α-, β-, γ-, è δ-giardines.Ci sò 21 membri di a famiglia di l'α-giardin, chì tutti anu una capacità calcium-dependent per ligà i fosfolipidi [16].Anu ancu cunnette u citoscheletru à a membrana cellulare.In l'individui cù diarrea causata da G. duodenalis, α-giardins sò assai espressi è immunoreattivu durante l'infezzione [17].I vaccini eterologi basati nantu à Giardia alfa-1 prutetti contra a giardiasi in i topi è sò potenziali antigeni candidati per u sviluppu di vaccini [18].Alpha-8 giardin, localizatu in a membrana plasmatica è flagella, ma micca in u discu ventrale, aumenta a motilità è a crescita di i trofozoiti in G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin attaches à e strutture microtubuli nantu à flagella è affetta a viabilità di G. duodenalis [20].L'alfa-11 giardine hè presente in abbundanza in tuttu u ciculu di vita, è l'overespressione di l'alfa-11 giardine dannu G. duodenalis stessu [21].In ogni casu, ùn hè micca chjaru se l'alfa-2 giardine è l'alfa-7.3 giardine sò protettivi contr'à l'infezzione da G. duodenalis è i so meccanismi sottostanti.
In questu studiu, i plasmidi di espressione eucariotica recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine è pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine sò stati trasfettati in macrophages peritoneali primari di u mouse per attivà l'ospite NLRP3.L'obiettivi di l'inflammasome sò stati allora screened.Avemu ancu valutatu u rolu di l'inflammasome NLRP3 in a patogenicità di G. duodenalis, investigatu se l'alfa-2 è l'alfa-7,3 giardine induiscenu l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 in vivo, è determinatu chì sti dui roli di giardine in a patogenicità di G. duodenalis.U nostru scopu cumuni era di sviluppà miri prometenti per a prevenzione di l'infezzione da G. duodenalis.
Tipu salvaticu (WT) C57BL / 6 topi femminili di età 5-8 settimane sò stati acquistati da Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Cina).I topi avianu accessu liberu à l'acqua, anu ricivutu alimentu sterilizatu è sò stati manteni in un ciculu di luce / scuru di 12/12 ore.Prima di l'infezzione, i topi anu ricivutu antibiotici ad libitum in acqua potabile supplementata cù ampicillina (1 mg/mL), vancomicina (1 mg/mL) è neomicina (1,4 mg/mL) (tutti acquistati da Shanghai, Cina, organismi artificiali) [22]. ].].I topi chì anu persu a capacità di manghjà è di beie per più di 24 ore è persu ≥ 20% di u pesu di u corpu sò stati eutanasiati umanamente da dislocazione cervicale.
I trofozoiti WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) sò stati supplementati cù 12,5% serum bovinu fetale (FBS; Every Green, Zhejiang, China) è 0,1% bile bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA). ).USA) in cundizioni microaerobiche.Trofozoiti cunfluenti sò stati cullati nantu à u ghjacciu è passanu in una proporzione di 1: 4 per più ripruduzzione.
I cisti di Giardia duodenum sò stati indotti cum'è descrittu prima [23], i trofozoiti sò stati raccolti in fase logaritmica è poi diluiti cù un mediu inducente di incapsulazione, pH 7,1 (TYI-S-33 modificatu) à una concentrazione finale di 1 × 106 trofozoiti / mL.cuncentrazione di bile 0.05% medium).I trofozoiti sò stati cultivati ​​in cundizioni anaerobichi à 37 ° C finu à a fase di crescita logaritmica.Cambià u mediu à u medio inducing cyst (pH 7.8; mudificatu TYI-S-33 medium cun 1% cuncentrazione di bile) è a cultura G. duodenalis à 37 ° C per l'ora di 48-96, durante quale i cisti di furmazione sò stati osservati sottu un microscopiu.Dopu chì a maiò parte di i trofozoiti sò stati indotti à furmà cisti, a mistura di cultura hè stata cugliera è resuspende in acqua deionizzata sterile per lisà i trofozoiti restante.I cisti sò stati cuntati è almacenati à 4 ° C per analisi successive attraversu un tubu gastricu in topi.
I vesiculi extracellulari di Giardia (GEV) sò stati arricchiti cum'è descrittu prima [13].I trofozoiti in a fase di crescita logaritmica sò stati resuspenditi in un mediu TYI-S-33 mudificatu preparatu cù FBS esosomi depleted (Industrie Biologiche, Beit-Haemek, Israele) à una concentrazione finale di 1 × 106 parassiti / mL è incubati per 12 ore.sò stati isolati da u supernatante di cultura per centrifugazione à 2000 g per 10 min, 10.000 g per 45 min, è 100.000 g per 60 min.I precipitati sò stati dissolti in saline buffered phosphate (PBS), quantificate cù un kit di analisi di proteina BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) è conservati à -80 ° C. o utilizati direttamente per più analisi.
I macrofagi peritoneali primari di i mouse sò stati preparati cum'è descrittu prima [24].In breve, i topi (età 6-8 settimane) sò stati injected (intraperitoneally [ip]) cù 2.5 ml di 2.98% Difco liquid thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) è alimentati 3-4 palati.Una sospensjoni di macrophages hè stata cullata da a cavità abdominale di i topi dopu l'eutanasia è centrifugata 3 volte à 1000 g per 10 min.E cellule raccolte sò state rilevate da citometria di flussu utilizendu u marcatore CD11b finu à chì a purità di e cellule hè stata > 98%, dopu aggiunte à piastre di cultura cellulare di 6 pozzetti (4,5 x 106 cellule / pozzu) è incubate cù 10% FBS (Bioindustria) à 37 ° C.è 5% CO2.
L'RNA hè stata estratta da 1 × 107 trofozoiti in 1 ml di reagenti TRIzol (Vazyme, Nanjing, Cina), l'ADN genomicu hè stata estratta da l'RNA tutale di G. duodenalis cù MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) è l'ADN cumplementariu (cDNA) hè stata sintetizzata. utilizendu MonScript RTIIII Super Mix (Monad) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
L'infurmazione di sequenza CDS per u genu di u G. duodenalis di destinazione hè stata ottenuta da u NCBI GenBank.Aduprate Primer 5.0 per cuncepisce primers di clonazione senza saldatura specifichi per ogni gene di destinazione.U primariu avanti (5′-3′) hè custituitu di trè parti: una sequenza sovrapposta cù un vettore linearizatu pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) è i codoni di partenza ATG è GNN (se a prima basa ùn hè micca G).Questu hè fattu per migliurà l'efficienza di l'espressione.Inoltre, almenu 16 bp basi cumminati (GC cuntenutu 40-60% / Tm circa 55 ° C).U primariu inversu (5'-3') hè custituitu di duie parti, una sequenza sovrapposta cù un vector pcDNA3.1(+) EcoRV-linearized (GCCGCCACTGTGCTGGAT) è una basa cumminata di almenu 16 bp.(escludendu l'ultimi dui tappe).basi) un codone cum'è AA o GA per permette à i plasmidi ricombinanti di sprime e so proteine ​​​​etichettate).I sequenze di prima sò listati in a Table 1 è sò stati sintetizzati da Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Targets sò stati amplificati cù Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) o Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) utilizendu preparatu G. duodenalis cDNA cum'è mudellu.U plasmide di u vettore di espressione eucariota pcDNA3.1(+) hè statu linearizatu cù l'enzima di restrizione EcoRV è defosforilatu cù Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Frammenti di pcDNA3.1(+) linearizzati è frammenti di geni di destinazione amplificati sò stati purificati cù un kit di purificazione di gel di DNA (Tiangen) è quantificati cù un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).U frammentu pcDNA3.1(+) è ogni fragmentu di u gene di destinazione sò stati ricombinati utilizendu a mistura di clonazione di assemblea unica MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) è cunfirmata da a sequenza di DNA cù Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Cina)..
I plasmidi senza endotossina pcDNA3.1(+)-alpha-2 è pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 sò stati generati cù u SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).A cuncentrazione hè stata mantenuta sopra 500 ng/µl per assicurà chì l'EDTA in u buffer d'eluzione ùn hà micca interferitu cù l'analisi di trasfezzione.I macrofagi peritoneali primari di u mouse sò stati cultivati ​​in platti di 6 pozzi cù un mediu RPMI 1640 cumpletu (Industria Biologica) per 12 ore, dopu e cellule sò lavate 3 volte in PBS caldu per caccià a penicillina è a streptomicina, è dopu in medium supplemented with full medium.I plasmidi senza endotossina pcDNA3.1(+)-alpha-2 è pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) sò stati diluiti in 125 μl di Opti-MEM medium serum ridutta (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Poi 5 µl di reagente di trasfezione Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) sono stati diluiti in 125 µl di mezzo Opti-MEM a bassa concentrazione di siero.Preparate i complexi di liposomi-ADN mischjendu u plasmide senza endotossina diluitu cù Lipofectamine 2000 è permette a mistura di stà à a temperatura di l'ambienti per 5 minuti.Trasferisce i cumplessi separatamente à e cellule in ogni pozzu è mischjà lentamente.Dopu à 4 ore, u mediu di cultura cellulare hè stata rimpiazzata cù 2 ml di mediu RPMI 1640 cumpletu è a cultura hè cuntinuata per 24 ore.U mediu di cultura di cellula fresca hè stata aghjuntu à e cellule è incubate per parechji punti di tempu secondu u disignu di l'analisi.
I campioni di proteine ​​​​da i supernatanti è i lisati di cellule sò stati preparati cum'è descrittu prima [25].I parametri di trasferimentu di membrana per pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, è His-tag eranu 200 mA/90 min.Per l'interleuchina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Svizzera) e NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Svizzera) e 1:5000 targeting His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Cina) è β-actina (Proteintech, Wuhan, Cina).
A cross-linking cù disuccinimide suberate (DSS) hè stata realizata cum'è descritta prima [26].Le cellule sono state lavate 3 volte con PBS freddo e completamente lisate con un ago 27 gauge in 50 µl di tampone di reazione ASC (pH 8,0) contenente 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES e 125 mM NaHCO3.A mistura hè stata centrifugata à 5000 g per 3 min è a pellet hè stata suturata cù 10 µl di DSS (25 mM in DMSO) è 40 µl di tampone di reazione ASC per 30 min à 37 ° C.Dopu a centrifugazione à 5000 g per 10 min, u pellet hè stata dissoluta in una soluzione di 40 µl di tampone di reazione ASC è 10 µl di tampone di carica di proteina 6x (TransGen, Beijing, China), è dopu a suluzione hè stata spenta à a temperatura ambiente per 15 minuti. min., Allora bolliri 10 minuti.I campioni di proteini sò stati sottumessi à Western blotting utilizendu anticorpi anti-ASC primari (Wanleibio, Shenyang, China) à un rapportu di diluzione di 1: 500.
Dopu una prucedura descritta prima [13], i supernatanti di a cultura cellulare sò stati raccolti è a secrezione di a citochina pro-inflammatoria IL-1β hè stata determinata cù u kit ELISA IL-1 Beta di mouse (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Cunvertite i valori OD450nm in concentrazioni di prutezione utilizendu a curva standard IL-1β.
Le cellule rivestite da coprioggetto sono state lavate delicatamente 3 volte in PBS caldo, fissate in un fissatore di cellule tissutali (Biosharp, Beijing, China) per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), in 0,1% Triton X-Permeabilize à 100 (diluitu in PBS; Biosharp). ) per 20 minuti à a temperatura di l'ambienti è bluccà in 5% di albumina di serum bovina (in PBS) per 2 ore à a temperatura di l'ambienti.E cellule sò state poi incubate durante a notte à 4 ° C cù anticorpi primari contr'à ASC (diluzione 1: 100) o NLRP3 (diluzione 1: 100), rispettivamente, è IgG anti-coniglio marcati Cy3 (H + L) (1: 400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) o IgG anti-mouse di capra cunjugata à FITC (1: 400; Earthox) durante a notte à 37 ° C in u bughju per 1 ora.I nuclei sò stati macchiati cù Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, Cina) per 5 minuti è osservati sottu un microscopiu di fluorescenza (Olympus Corporation, Tokyo, Giappone).
I topi sò stati divisi in quattru gruppi (n = 7 in ogni gruppu): (i) Gruppu di cuntrollu negativu trattatu cù PBS (PBS solu; gavage 100 µl / mouse PBS seguita da iniezione intraperitoneale di ogni ghjornu 100 µl / mouse PBS 3 ore dopu)., continuamente per 7 ghjorni);(ii) gruppu di cuntrollu negativu trattatu cù inhibitore MCC950 [27] (100 µl / mouse via PBS gavage, 3 ore dopu, 10 mg / kg di pesu corpu [BW] MCC950 [in PBS] hè stata amministrata intraperitoneally ogni ghjornu, durata 7 ghjorni);(iii) G. duodenalis cyst infection group (1,5 x 106 cysts/mouse by gavage, 3 hours later, 100 μl/mouse PBS intraperitoneally administered daily for 7 days);(iv) G. duodenalis cyst cumminatu infezzione gruppu MCC950 inhibitor treatment group (1.5 × 106 cysts / mouse via gavage, 10mg / kg body weight MCC950 intraperitoneally daily for 7 days at 3h).U pesu di u corpu di ogni topu hè stata monitorata ogni ghjornu è tutti i topi sò stati eutanasiati in u 7u ghjornu.Duodenu cugliera (3 cm long) hè stata tagliata in picculi pezzi in 1 ml PBS, i cisti sò stati distrutti durante a notte in PBS à 4 ° C, è G. duodenalis trophozoites.Duodenu frescu (1 cm longu) hè statu isolatu per a colorazione di hematoxilina è eosina (H&E).
I topi sò stati divisi in dui gruppi: (i) gruppu di cuntrollu MOCK è (ii) gruppu inhibitore MCC950.Ci era cinque trattamenti in ogni gruppu (n = 7 / gruppu di trattamentu): (i) Gruppu di cuntrollu negativu di trattamentu PBS (PBS solu; 100 µl / mouse PBS, iniezione intramusculare (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) gruppu di cuntrollu negativu di plasmidi (100 µg/mouse DNA, via injection intramuscular) (iii) G. duodenalis cyst infection positive control group (1,5 x 106 cysts/mouse, via gavage) (iv) a; gruppu trattatu cù u plasmide pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/ADN di mouse, per iniezione intramusculare), è (v) un gruppu trattatu cù u plasmide pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/mouse). DNA, dopu à 12 ore di passaghju, i topi in u gruppu inhibitore MCC950 anu ricivutu una iniezione intraperitoneale ogni ghjornu di MCC950 (10 mg / kg di pesu di corpu) per 7 ghjorni, mentre chì i topi in u gruppu MOCK anu ricivutu un voluminu uguali di trattamentu PBS. raccolti da i topi oculari è lasciati durante a notte à 4 ° C I campioni di sieru sò stati isolati cù l'analisi immunosorbente enzyme-linked (ELISA) per e misurazioni di i livelli di IL-1β.
Trentacinque surci sò stati divisi in cinque gruppi (n = 7 / gruppu).U gruppu 1 era un gruppu di cuntrollu negativu trattatu cù PBS: i topi anu ricevutu 100 μl di PBS intramuscularmente è 3 ghjorni dopu per gavage.U gruppu 2 hè un gruppu di cuntrollu pusitivu infettatu cù cisti di G. duodenalis: i topi sò stati injected cù 100 μl di PBS, è 3 ghjorni dopu 1,5 x 106 cysts / mouse sò stati injected intragastrically.Terzu gruppu - immunizazione di plasmidi cù pcDNA3.1(+) in combinazione cù un gruppu di cuntrollu per l'infezione di cisti duodenali: i topi anu ricevutu 100 μg di DNA plasmidicu pcDNA3.1(+)(im) per via orale, 1.5 × 106 cisti / mouse 3 per parechji ghjorni.Gruppi 4 è 5 eranu recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid in combine with G. duodenalis cyst infection.Gruppu sperimentale: i topi anu ricevutu 100 µg di pcDNA3.1(+)-giardine plasmidi DNA (im), poi 3 ghjorni dopu, 1,5 × 106 cisti / mouse sò stati iniettati via gavage.U pesu di u corpu di ogni mouse hè stata monitorata dopu l'intruduzioni di u G. duodenalis cyst à traversu u tubu.U duodenu frescu hè statu recullatu per e misurazioni di carica parassita è l'analisi di colorazione HE.
I cambiamenti istopatologichi sò stati analizati secondu una prucedura publicata prima [30].U duodenu frescu hè statu fissatu cù un fissatore di cellule tissulali, incrustatu in paraffina, tagliatu in sezioni di 4 μm, macchiatu cù H&E è analizatu sottu un microscopiu luminoso.I cambiamenti patologichi rapprisentanti in sette sezioni di tissuti da sette topi indipendenti sò stati valutati da un patologu chì ùn cunnosci micca u trattamentu è sò stati catturati à un ingrandimentu 200x.A durata di i villi è a prufundità di e cripte sò stati misurati in cunfurmità cù i metudi descritti prima.
I risultati in vitro è in vivo sò stati ottenuti in triplicate.I grafici sò stati generati cù GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).E differenze trà dui gruppi sò stati analizati da t-test, mentre chì e differenze trà i gruppi ≥3 sò stati analizati da l'analisi unidirezionale di a varianza (ANOVA) cù u software SPSS (versione 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).I dati sò stati analizati per l'homogeneità di a varianza utilizendu a prova di Levene seguita da a prova post hoc di Bonferroni (B).A significazione hè espressa cum'è P <0.05, P <0.01, è P <0.001 (micca significativa [ns]) (P>0.05).
A nostra analisi precedente di a proteomica GEV in l'Enciclopedia di Kyoto di Genes and Genomes (KEGG) hà dimustratu chì parechji miri ponu esse implicati in l'attivazione di e vie di signalazione infiammatoria [13].Avemu sceltu dui miri promettenti, alpha-2 è alpha-7.3 giardins, amplifichimu queste molecule è l'utilizanu per custruisce u vettore d'espressione eucarioticu pcDNA3.1(+).Dopu a sequenza, i plasmidi d'espressione recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 è alfa-7.3 giardine sò stati trasfettati in macrofagi peritoneali primari di mouse, è a proteina di firma caspase-1 p20 di l'inflammazione (un frammentu di caspase-1 attivata) hè stata identificata. cum'è elucidating molécule chjave chì ponu attivà inflammazioni.I risultati anu dimustratu chì l'alfa-2 è l'alfa-7.3 giardines ponu induce l'espressione p20 caspase-1 simili à GEV.Nisun effettu nantu à l'attivazione di caspase-1 hè statu trovu in u cuntrollu negativu senza trattamentu (PBS solu) è u cuntrollu di plasmidi pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Misurazione di l'attivazione di p20 caspase-1 da pcDNA3.1(+)-alpha-2 è alpha-7.3 giardins.Plasmidi d'espressione eucariotica recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 è alpha-7.3 giardines (sopra ogni corsia) sò stati trasfettati in macrophages peritoneali primari di mouse è i supernatanti di cultura sò stati raccolti 24 ore dopu.Western blotting hè stata utilizata per misurà i livelli di espressione di a proteina inflammasome caspase-1 p20 di firma.U gruppu di trattamentu solu PBS (lane C) è u gruppu di monoterapia pcDNA3.1(+) (pcDNA3.1 lane) sò stati utilizati com'è cuntrollu negativu, è u gruppu di trattamentu GEV hè stata utilizata com un cuntrollu pusitivu.L'espressione di a proteina recombinante hè stata cunfirmata da a rilevazione di un tag histidine in ogni proteina, è e bande di prutezione previste eranu alfa-2 giardine (38.2 kDa) è alfa-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, vesicule extracellulare di Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vettore linearizzato EcoRV, SUP, surnatante
Per determinà se l'alfa-2 giardine è l'alfa-7.3 giardine inducenu l'espressione p20 caspase-1 è ghjucanu un rolu in l'attivazione di a risposta inflammatoria di l'ospite NLRP3, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine è pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin hè stata trasfettata in macrophages peritoneali di u mouse primariu cù DNA plasmidi recombinante, è i livelli di espressione, localizazione è oligomerizazione di e proteine ​​​​inflamatorii chjave NLRP3 sò stati determinati.In questu esperimentu, GEV hè stata utilizata cum'è u gruppu di cuntrollu pusitivu, è u gruppu senza trattamentu (PBS solu) o u gruppu di trattamentu di trasfezzione pcDNA3.1(+) era u gruppu negativu.I risultati anu dimustratu chì, cum'è in u gruppu GEV, l'ADN plasmidicu recombinante di giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 è giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 hà risultatu in upregulation di NLRP3, pro-IL-1β è attivazione procaspase-1 è caspase-1 (Fig. 2a).Inoltre, e duie giardine inducevanu una secrezione significativa di IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Figura 2b).A maiò parte di e proteine ​​​​ASC eranu monomeriche in u gruppu senza trattamentu o in u gruppu di trattamentu trasfettatu cù u plasmid pcDNA3.1(+), in cuntrastu à pcDNA3.1(+)-alpha-2 o pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 giardina.L'oligomerizazione ASC hè accaduta in u DNA plasmidi recombinante di u gruppu o gruppu di cuntrollu pusitivu GEV, chì mostra una forma oligomerica (Figura 2c).Questi dati preliminari suggerenu chì l'alfa-2 giardine è l'alfa-7,3 giardine ponu induce l'attivazione di a inflamazioni NLRP3.Studi immunofluorescenti successivi di a localizazione di ASC è NLRP3 dimustranu chì in u gruppu di cuntrollu negativu, a proteina ASC hè spargugliata in u citoplasma è apparsu cum'è un signalu di puntu nantu à l'estimulazione di pcDNA3.1(+)-alfa-2 cù giardine o pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 gruppu giardine o gruppu di cuntrollu pusitivu GEV (Figura 2d).In u cuntrollu negativu è i gruppi pcDNA 3.1 trattati cù plasmidi, u signale di a proteina NLRP3 ùn hè statu rilevatu, mentre chì un puntu di signale fluorescente in risposta à pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 hè statu rilevatu..giardine si trovanu in u citoplasma o nantu à stimulazione di u HEV (Fig. 2e).Sti dati dimustranu ancu chì G. duodenalis giardin alpha-2 è giardin alpha-7.3 attivate l'inflammasome NLRP3 in i macrophages peritoneali primari di u mouse.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin è pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin attivanu l'inflammasome NLRP3 in i macrophages peritoneali di u mouse.Trasfetta i plasmidi di espressione eucariotica ricombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin è pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin in macrofagi è cellule peritoneali murini primari, o raccoglie u supernatante in 24 ore per l'analisi di espressione, oligomerizzazione , secrezione.è a localizazione di e proteine ​​​​inflamatorii chjave.U gruppu PBS-solu (C) è u gruppu di trattamentu unicu pcDNA3.1(+) sò stati utilizati com'è cuntrollu negativu, è u gruppu di trattamentu GEV hè stata utilizata cum'è u gruppu pusitivu.a Proteine ​​inflamatorii chjave NLRP3, cumprese NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 è p20 caspase-1, sò state rilevate da Western blotting.b I livelli di secrezione di IL-1β in i supernatanti sò stati determinati cù l'analisi immunosorbente enzyme-linked (ELISA).E differenze trà i gruppi di cuntrollu è sperimentali sò stati analizati da l'analisi unidirezionale di a varianza (ANOVA) utilizendu a versione di u software SPSS 22.0.L'asterischi indicanu differenze significative trà i gruppi **P<0,01 è ***P<0,001.c I livelli di oligomerizazione ASC in pellets sò stati determinati da l'analisi di cross-linking DSS, mentre chì i livelli ASC in lisati di cellula sò stati utilizati com'è cuntrollu di carica.d Visualizazione di a localizazione ISC cù l'immunofluorescenza.e L'immunofluorescenza hè stata aduprata per visualizà a localizazione di NLRP3.ASC, proteina apoptotica simile a speck;IL, interleukin;NLRP3, nucleotide-binding oligomerization-like receptor 3;ns, micca significativu (P > 0,05)
Tanti G. duodenalis è i GEV chì secrete attivanu l'inflammasome NLRP3 è regulanu e risposti inflammatory host in vitro.Cusì, u rolu di l'inflammasome NLRP3 in a patogenicità di G. duodenalis ùn hè micca chjaru.Per investigà stu prublema, avemu disignatu un esperimentu trà i topi infettati cù G. duodenalis cyst è topi infettati cù G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor treatment è paragunatu l'espressione inflammasome NLRP3 quandu infettatu cù G. duodenalis cyst.Un schema detallatu di l'esperimentu hè mostratu in Fig.I cambiamenti in u pesu di u corpu di i topi in diversi gruppi di trattamentu sò stati monitorati per 7 ghjorni dopu l'infezzione cù cisti, è i risultati sò mostrati in Fig. 3b.Comparatu à u gruppu trattatu cù PBS puri, i risultati dimustranu chì (i) u pesu di u corpu di i topi infettati cù G. duodenalis cyst diminuite da u ghjornu 3 à u ghjornu 7 dopu l'infezzione;(ii) u trattamentu cù l'inhibitore MCC950 ùn hà micca un effettu significativu nantu à u pesu di u corpu di i topi..Comparatu à u gruppu di infezzione unicu, u BW di u gruppu di infezzione duodenale trattatu cù MCC950 diminuì à varii gradi (Day 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Day 2: ANOVA, F(3, 24). ) = 0.4602, P <0.0001 Day 3: ANOVA, F (3, 24) = 0.8360, P = 0.0010 Day 4: ANOVA, F (3, 24) = 1.683, P = 0.0052: ANOVA; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645 Day 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Questi dati dimustranu chì l'inflammasome NLRP3 pruteghja i topi da a perdita di pisu significativa in i primi stadi (2-4 ghjorni) di l'infezione duodenale.Dopu avemu scopu di detectà i trofozoiti di G. duodenalis in u fluidu di lavage duodenali è i risultati sò mostrati in Figura 3c.Comparatu à u gruppu d'infezzione di cisti di G. duodenalis, u nùmeru di trofozoiti in u duodenu hà aumentatu significativamente dopu à bluccà l'inflammasome NLRP3 (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Tessuti duodenali macchiati cù HE dimustratu, cumparatu cù u cuntrollu negativu trattatu cù PBS è MCC950 solu: (i) L'infezione di G. duodenalis cyst hà risultatu in danni à i villi duodenali (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) è atrofia criptu (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenu da i topi infettati cù cisti di G. duodenalis è trattati cù inhibitori MCC950.villi duodenali sò stati danati è morti (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) cù atrofia è ramificazione di cripta (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d-). f) .Questi risultati suggerenu chì l'inflammasome NLRP3 ghjoca un rolu à riduce a patogenicità di G. duodenalis.
Role di l'inflammasome NLRP3 in l'infezione di Giardia duodenum.I topi sò stati gavaged (iv) cù cisti duodenococcali è poi trattati cù o senza MCC950 (ip).I gruppi di trattamentu unicu cù PBS o MCC950 sò stati utilizati cum'è cuntrolli.Gruppu sperimentale è regime di trattamentu.b U pesu di u corpu di i topi in ognuna di i diversi gruppi di trattamentu hè stata monitorata per 7 ghjorni.A diffarenza trà u gruppu d'infezzione di G. duodenalis è u gruppu di trattamentu d'infezzione G. duodenalis + MCC950 hè stata analizata da t-test cù a versione di u software SPSS 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à *P<0,05, **P<0,01, ou ***P<0,001.c Carica parasitica hè stata determinata cuntendu u nùmeru di trofozoiti in u fluidu di lavage duodenale.A diffarenza trà u gruppu d'infezzione di G. duodenalis è u gruppu di trattamentu d'infezzione G. duodenalis + MCC950 hè stata analizata da t-test cù a versione di u software SPSS 22.0.L'asterischi indicanu differenze significative à * P < 0,05.d Ematossilina e eosina (H&E) risultati di colorazione di istopatologia duodenale.E frecce rosse indicanu danni à i villi, e frecce verdi indicanu danni à e cripte.Barre d'échelle : 100 µm.e, f Analisi statistica di l'altezza di villosità duodenale è di l'altezza di a cripta di u mouse.Les astérisques indiquent des différences significatives à * P < 0,05 et ** P < 0,01.I risultati sò pigliati da 7 esperimenti biologichi indipendenti.BW, pisu corpu;ig, via di consegna intragastrica;ip, via di consegna intraperitoneale;ns, micca significativu (P > 0,05);PBS, salina tamponata fosfatatu;WT, tipu salvaticu
A secrezione di IL-1β hè un segnu di l'attivazione di l'inflammazione.Per determinar se G. duodenalis alpha-2 giardine è alpha-7.3 giardine attivate l'inflammasome host NLRP3 in vivo, avemu usatu topi WT senza trattamentu (gruppu sham) è topi NLRP3 inflammasome-blocked (gruppu di trattamentu inhibitu MCC950).Un schema detallatu di l'esperimentu hè mostratu in Fig. 4a.Gruppi spirimintali cunsistenti di topi trattati cù PBS, trattamentu di cisti di G. duodenalis per gavage, injection intramuscular di pcDNA3.1, è injection intramuscular di pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.U 7u ​​ghjornu dopu l'amministrazione intramusculare di u plasmid recombinante, u serum hè stata cullata è u nivellu di IL-1β in ogni gruppu hè statu determinatu.Cum'è mostra in a Figura 4b, in u gruppu MOCK: (i) cumparatu à u gruppu PBS, u trattamentu pcDNA3.1 ùn hà micca avutu un effettu significativu nantu à a secrezione IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), in ogni modu, A secrezione di IL-β era significativamente elevata in u gruppu di cisti di G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine è pcDNA3.1- L'injection intramuscular di alfa-7.3 giardine aumentò significativamente i livelli serum IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine induce high levels of IL -1β secretion in the pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Comparatu cù ogni gruppu in u gruppu di trattamentu MCC950 è u gruppu MOCK: (i) I livelli di secrezione IL-1β in u gruppu di cuntrollu PBS è u gruppu di cuntrollu di pcDNA3.1 diminuinu à un certu puntu dopu à bluccà l'inhibitore MCC950, ma a diferenza ùn era micca. significativu (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) dopu avè bluccatu MCC950., A secrezione di IL-1β hè stata ridutta significativamente in u gruppu infettatu da cisti di G. duodenalis, u gruppu di giardine pcDNA3.1-alpha-2 è u gruppu di giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540, P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (9, 58). ) = 3,540, P = 0,0164).Questi risultati suggerenu chì l'alfa-2 giardine è l'alfa-7.3 giardine mediate l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines attivanu l'inflammasome host NLRP3 in vivo.I topi sò stati immunizzati (IM) cù plasmidi di espressione eucariotica recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine è poi trattati cù MCC950 (ip; gruppu MCC950) o micca (gruppu dummy). ).U gruppu di trattamentu di plasmidi PBS o pcDNA3.1(+) hè stata utilizata cum'è un cuntrollu negativu, u gruppu di trattamentu di G. duodenalis cyst hè stata utilizata com un cuntrollu pusitivu.Gruppu sperimentale è regime di trattamentu.b I livelli sierici di IL-1β in i topi sò stati misurati u ghjornu 7 da un test ELISA.E differenze trà i gruppi in u gruppu MOCK sò stati analizati utilizendu ANOVA unidirezionale, è e differenze trà u gruppu MOCK è u gruppu MCC950 sò stati analizati cù u t-test di a versione di u software SPSS 22.0.L'asterischi indicanu differenzi significati trà i gruppi di trattamentu in u gruppu MOCK, * P <0.05 è *** P <0.001;i segni di dòlar ($) indicanu differenzi significati trà ogni gruppu in u gruppu MOCK è u gruppu MCC950 à P<0.05.Risultati di sette esperimenti biologichi indipendenti.i, iniezione intramuscular, ns, micca significativu (P > 0,05)
Per investigà l'effettu di l'attivazione mediata da l'alfa-2 è l'alfa-7.3 giardine di l'inflammasome host NLRP3 in G. duodenalis infectivity, avemu usatu WT C57BL / 6 surci è injected alpha-2 giardine è alfa-7.3 giardine.u plasmide hè stata injected intramuscularly, dopu à 3 ghjorni à traversu u tubu gastricu di u G. duodenalis cyst, dopu chì i surci anu osservatu per 7 ghjorni.Un schema detallatu di l'esperimentu hè mostratu in Fig. 5a.U pesu di u corpu di ogni surci hè statu misuratu ogni ghjornu, i campioni di u tessulu duodenale frescu sò stati cullati in u 7u ghjornu dopu l'amministrazione per un tubu gastricu, u nùmeru di trofozoiti hè statu misuratu è i cambiamenti istopatologichi sò stati osservati.Cum'è mostra in a Figura 5b, cù l'aumentu di u tempu di alimentazione, u BW di i topi in ogni gruppu aumentò gradualmente.U MT di i topi hà cuminciatu à diminuite nantu à u 3rd ghjornu dopu l'amministrazione intragastricu di G. duodenalis cysts, è poi aumentò gradualmente.L'attivazione di l'inflammasome NLRP3 indotta da iniezione intramusculare di alfa-2 giardine è alpha7.3 giardine attenua significativamente a perdita di pisu in i topi (Day 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0.9754 Day 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0.9987 Day 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.9979 Day 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 Day 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Day 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 Day 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Day 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Day 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Day 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Day 6: pcDNA3 .1 - alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Day 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Day 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Day 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001).A carica parasitica hè stata evaluata in u duodenu (Fig. 5c).Comparatu à u cuntrollu pusitivu senza trattatu è u gruppu injected cù u vettore pcDNA3.1 viotu, u numaru di trofozoiti di G. duodenalis hè stata significativamente ridutta in i gruppi injected with α-2 giardine è α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P <0.0001).Inoltre, giardine alfa-7.3 era più protettiva in i topi cà giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).I risultati di a tintura HE sò mostrati in a fig.5d-f.Mice injected with alpha-2 giardine è alpha-7.3 giardine avianu menu lesioni di tissuti duodenali, manifestatu da danni villus, paragunatu à i topi injected with G. duodenalis è i topi injected with G. duodenalis in cumbinazioni cù un viotu pcDNA3 vector .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 o P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0,0028 o P = 0,0055) è atrofia di cripta ridotta (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 o P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 o P = 0,0191).Questi risultati suggerenu chì l'alfa-2 giardine è l'alfa-7,3 giardine reduce l'infezzione di G. duodenalis attivendu l'inflammasome NLRP3 in vivo.
Role of pcDNA3.1(+)-giardins in G. duodenalis infection.I topi sò stati immunizzati (IM) cù plasmidi d'espressione eucarioti recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine è dopu sfidatu cù cisti di G. duodenalis (ig).U gruppu PBS è u gruppu pcDNA3.1(+) + u gruppu di trattamentu di cisti duodenali sò stati utilizati cum'è gruppi di cuntrollu negativu, è u gruppu di trattamentu di cisti duodenali hè stata utilizata cum'è gruppu di cuntrollu pusitivu.Gruppu sperimentale è regime di trattamentu.b A MT di i topi in ognuna di i diversi gruppi di trattamentu hè stata monitorata per 7 ghjorni dopu a sfida.Asterischi indicanu differenzi significati trà i gruppi in u gruppu G. duodenalis è u gruppu pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, * P <0.05, **P <0.01, è ***P <0.001;u signu di u dòricu ($) indica una diferenza significativa trà ogni gruppu di G. duodenalis è u gruppu pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 è $$$P<0.001.c A carica parasitica hè stata determinata cuntendu u numeru di trofozoiti in 1 ml di lavu duodenale da u duodenu (3 cm long) è spressione cum'è u numeru di parasites per cm di duodenu.Differenze trà u gruppu di infezzione di G. duodenalis, u gruppu di giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, è u gruppu di giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 sò stati analizati da ANOVA unidirezionale cù a versione di u software SPSS 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à **P<0,01 et ***P<0,001.d Cambiamenti istopatologichi in u duodenu.E frecce rosse indicanu danni à i villi, e frecce verdi indicanu danni à e cripte.Barre d'échelle : 100 µm.e, f Analisi statistica di l'altezza di villosità duodenale di u mouse (e) è l'altezza di a cripta (f).E differenze trà i gruppi in a Figura 1d sò state analizate da ANOVA unidirezionale utilizendu a versione di u software SPSS 22.0.Les astérisques indiquent des différences significatives à * P < 0,05 et ** P < 0,01.Risultati di sette esperimenti biologichi indipendenti.ns, micca significativu (P > 0,05)
Giardia duodenum hè un parasite intestinali ben cunnisciutu di l'omu è di altri mammiferi chì provoca giardiasis.In u 2004, hè stata inclusa in l'Iniziativa di Malattie Trascurate di l'OMS per via di a so alta prevalenza annantu à 6 anni, soprattuttu in e cumunità di statu socioeconomicu bassu [32].U sistema immune innate ghjoca un rolu criticu in a risposta immune à l'infezzione da G. duodenalis.I macròfagi di i mouse sò stati rappurtati per engulf è tumbà G. duodenalis liberando trappule extracellulari [33].I nostri studii precedenti anu dimustratu chì G. duodenalis, un parasite extracellular non invasivu, attiva p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, è NLRP3 inflammatory signaling pathways in mouse macrophages per regulà e risposti inflammatorii di l'ospiti, è GEV liberatu pò rinfurzà stu prucessu.13], 24].Tuttavia, i PAMP esatti implicati in l'infiammazione regulata da l'inflammasome NLRP3 in GEV è u rolu di l'inflammasome NLRP3 in a giardiasi restanu da esse elucidati.Per fà luce nantu à queste duie dumande, avemu realizatu stu studiu.
L'inflammasome NLRP3 si trova in u citoplasma di e cellule immune è pò esse attivatu da diverse particelle cum'è cristalli d'acidu uricu, tossine, batteri, virus è parassiti.In studii batterichi, e tossine sò state identificate cum'è PAMP chjave chì attivanu i sensori inflammatorii, chì portanu à a inflamazioni è a morte cellulare [34].Alcune tossine strutturalmente diverse, come l'emolisina da Staphylococcus aureus [35] e Escherichia coli [36], l'emolisina BL (HBL) da enterotossina (NHE) [37], inducono l'attivazione dell'infiammazione NLRP3.Studi virali anu dimustratu chì e proteine ​​​​di virulenza cum'è a proteina di l'envelope SARS-COV-2 (E) [38] è a proteina NS5 di virus Zika [39] sò PAMP impurtanti ricunnisciuti da u receptore NLRP3.In i studii parassiti, parechji parassiti sò stati signalati per esse assuciati cù l'attivazione di l'inflammasome host, cum'è Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] è Leishmania [42].I densi proteini granuli GRA35, GRA42 è GRA43, assuciati à a virulenza di Toxoplasma gondii, sò necessarii per l'induzione di piroptosi in i macrofagi di ratti di Lewis [43].Inoltre, certi studii di Leishmania anu focu annantu à molécule individuali implicate in l'inflammasome NLRP3, cum'è u lipofosfoglicanu di a membrana di parasite [44] o metalloproteasi di zincu [45].Trà a famiglia di genesi alfa-giardin-like annexin, l'alfa-1 giardin hè statu dimustratu per esse un candidatu potenziale vaccine chì furnisce a prutezzione contru G. duodenalis in un mudellu di mouse [18].In u nostru studiu, avemu sceltu G. duodenalis virulence factors alpha-2 è alpha-7,3 giardines, chì sò unichi di giardia, ma relativamente menu infurmati.Questi dui geni di destinazione sò stati clonati in u vettore di sistema di espressione eucariota pcDNA3.1(+) per l'analisi di l'attivazione di l'infiammazione.
In u nostru mudellu di mouse, i frammenti di caspase cleaved servenu cum'è marcatori di attivazione inflamatoria.Dopu à a stimulazione, NLRP3 interagisce cù ASC, recluta procaspases, è genera caspases attive chì scindanu pro-IL-1β è pro-IL-18 in IL-1β mature è IL-18, rispettivamente -18.I caspasi infiammatori (caspases-1, -4, -5 è -11) sò una famiglia cunservata di cisteina proteasi chì sò critichi per a difesa innata è sò implicati in l'infiammazione è a morte cellulare programata [46].A caspase-1 hè attivata da inflammasomes canonichi [47], mentri caspases-4, -5, è -11 sò cleaved durante a furmazione di inflammasomes atipici [48].In questu studiu, avemu usatu macrophages peritoneali di u mouse cum'è mudellu è investigatu p20 caspase-1 cleaved caspase-1 cum'è un marcatore di l'attivazione di l'inflamazioni NLRP3 di l'ospite in studii di l'infezzione di G. duodenalis.I risultati anu dimustratu chì parechji alfa-giardini sò rispunsevuli di l'attivazione tipica di l'infiammazione, chì hè coherente cù a scuperta di molécule di virulenza chjave implicate in bacteria è virus.In ogni casu, u nostru studiu hè solu un schermu prelimiunale è ci sò altre molécule chì ponu attivà inflammasomes non-classichi, cum'è u nostru studiu precedente hà truvatu inflammasomes classici è non-classichi in l'infezzione di G. duodenalis [13].Per determinà ulteriormente se a p20 caspase-1 generata hè assuciata à l'inflammasome NLRP3, avemu trasfettatu alpha-2 è alpha-7.3 giardines in macrofagi peritoneali di u mouse per determinà i livelli di espressione di proteina di molecule chjave è i livelli di oligomerizazione ASC, cunfirmendu chì i dui α-giardini attivanu. inflammasome NLRP3.I nostri risultati sò un pocu sfarente da quelli di Manko-Prykhoda et al., chì anu infurmatu chì l'estimulazione di e cellule Caco-2 cù ceppi EPEC di G. muris o E. coli sola pò aumentà l'intensità di fluorescenza di NLRP3, ASC è caspase-1, ancu s'ellu ùn hè micca significativu, mentre chì a costimulazione di G. muris è E. coli hà aumentatu i livelli di trè proteini [49].Questa discrepanza pò esse duvuta à e differenze in a selezzione di spezie di Giardia, linee di cellule è cellule primarie.Avemu ancu realizatu analisi in vivo cù MCC950 in 5-week-old female WT C57BL / 6 surci, chì sò più suscettibili à G. duodenalis.MCC950 hè un inibitore putente è selettivu di piccula molecula NLRP3 chì blocca l'attivazione di NLRP3 canonica è non canonica à concentrazioni nanomolari.MCC950 inibisce l'attivazione di NLRP3, ma ùn affetta micca l'attivazione di e vie infiammatorie AIM2, NLRC4 è NLRP1 o camini di segnalazione TLR [27].MCC950 blocca l'attivazione di NLRP3 ma ùn impedisce micca l'iniziu di NLRP3, l'efflussu di K +, l'influssu di Ca2 +, o l'interazzione trà NLRP3 è ASC;invece, inibisce l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 bluccà l'oligomerizazione ASC [27].Dunque, avemu usatu MCC950 in un studiu in vivo per determinà u rolu di l'inflammasome NLRP3 dopu l'iniezione di giardine.La caspase-1 p10 attivata scinde les citochine pro-infiammatorie pro-IL-1β e pro-IL-18 in IL-1β e IL-18 mature [50].In questu studiu, i livelli di serum IL-1β in i topi trattati cù giardine cù o senza MCC950 sò stati utilizati com'è un indicatore di se l'inflammasome NLRP3 hè stata attivata.Comu s'aspittava, u trattamentu MCC950 hà riduciutu significativamente i livelli di IL-1β serum.Questi dati dimustranu chjaramente chì G. duodenalis giardin alfa-2 è giardin alfa-7.3 sò capaci di attivà l'inflammasome mouse NLRP3.
Dati significativi accumulati annantu à l'ultimi decennii anu dimustratu chì IL-17A hè u regulatore maestru di l'immunità contr'à G. muris, inducendu a signalazione di IL-17RA, pruducendu peptidi antimicrobiali è regula l'attivazione di u cumplementu [51].In ogni casu, l'infezzione di Giardia si faci più freti in i ghjovani adulti, è hè statu infurmatu chì l'infezzione di Giardia in i topi ghjovani ùn attivate micca a risposta IL-17A per esercite u so effettu protettivu [52], chì incita i circadori à circà altre Giardia immunomodulatori.i miccanismi di l'infezzione helminth.L'autori di un studiu recente anu infurmatu chì G. muris pò attivà l'inflammasome NLRP3 da E. coli EPEC, chì prumove a produzzione di peptidi antimicrobiali è riduce a so capacità di attache è u nùmeru di trofozoiti in u trattu intestinali, riducendu cusì a gravità di u colon. malatie causate da bacilli [49].L'inflammasome NLRP3 hè implicatu in u sviluppu di diverse malatie.I studii anu dimustratu chì Pseudomonas aeruginosa attiva l'autofagia in i macrophages per evità a morte di e cellule, è questu prucessu dipende da l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 [53].Per N. caninum, l'attivazione mediata da e spezie di l'ossigenu reattivu di l'inflammasome NLRP3 limita a so replicazione in l'ospiti, facendu un scopu terapeuticu potenziale [9].Paracoccidioides brasiliensis hè statu truvatu per induce l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 in e cellule dendritiche derivate da a moda ossea di u mouse, risultatu in a liberazione di a citocina inflammatoria IL-1β, chì ghjoca un rolu criticu in a difesa di l'ospite [10].Diversi spezie di Leishmania, cumpresi L. amazonensis, L. major, L. braziliensis è L. infantum chagasi, attivanu NLRP3 è ASC-dependent caspase-1 in macrophages, è ancu l'infezzione di Leishmania.A replicazione di parassiti hè rinfurzata in i topi deficienti in u genu NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.L'infezione da Leishmania hè stata informata per induce l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 in i macrophages, chì limita a replicazione intracellulare di parasite.Cusì, Leishmania pò inibisce l'attivazione di NLRP3 cum'è una strategia di evità.In studii in vivo, l'inflammasome NLRP3 hà cuntribuitu à l'eliminazione di Leishmania, ma ùn hà micca affettatu i tessuti [54].À u cuntrariu, in i studii di l'helminthiasis, l'attivazione di l'inflammasome NLRP3 suppressa l'immunità protettiva di l'ospite contr'à l'helminthiasis gastrointestinali [12].Shigella hè unu di i principali batteri chì causanu diarrea in u mondu sanu.Questi battìri ponu induce a produzzione di IL-1β per mezu di l'efflussu K + mediatu da u receptore P2X7, spezie reattive di l'ossigenu, acidificazione lisosomiale è danni mitocondriali.L'inflammasome NLRP3 regula negativamente a fagocitosi è l'attività bactericida di i macrophages contru Shigella [55].Studi di Plasmodium anu dimustratu chì i topi deficienti di AIM2, NLRP3 o caspase-1 infettati da Plasmodium producenu alti livelli di interferone di tipu 1 è sò più resistenti à l'infezzione di Plasmodium [56].Tuttavia, u rolu di l'alfa-2 giardine è l'alfa-7.3 giardine in l'induzione di l'attivazione patogena di l'inflamazioni NLRP3 in i topi ùn hè micca chjaru.
In questu studiu, l'inibizione di l'inflammasome NLRP3 da MCC950 hà riduciutu u BW è hà aumentatu u nùmeru di trofozoiti in u fluidu di lavu intestinali in i topi, risultatu in cambiamenti patologichi più severi in u tissue duodenale.L'alfa-2 giardine è l'alfa-7.3 giardine attivanu l'inflammasome NLRP3 di u mouse di l'ospite, aumentanu u pesu di u corpu di u mouse, riducenu u nùmeru di trofozoiti in u fluidu di lavaggio intestinali è allevianu e lesioni duodenali patologiche.Questi risultati suggerenu chì G. duodenalis pò attivà l'inflammasome host NLRP3 via alpha-2 giardine è alpha-7,3 giardine, riducendu a patogenicità di G. duodenalis in i topi.
Cullittivamenti, i nostri risultati dimustranu chì l'alfa-2 è l'alfa-7.3 giardine induce l'attivazione di l'inflammasome host NLRP3 è riduce l'infettività di G. duodenalis in i topi.Per quessa, sti molécule sò miri prometenti per a prevenzione di giardiasi.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
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