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Toxoplasma gondii hè un parassita protozoicu intracellulare chì modula u microambientu di l'ospite infettatu è hè cunnisciutu per esse assuciatu cù l'incidenza di a crescita di tumore cerebrale.In questu studiu, ipotisemu chì u miRNA-21 exosomal da l'infezzione Toxoplasma prumove a crescita di tumore cerebrale.L'esosomi da a microglia BV2 infettata da Toxoplasma sò stati carattarizati è l'internalizazione di e cellule di glioma U87 hè stata cunfirmata.I profili di espressione di microRNA esosomali sò stati analizati utilizendu array di microRNA è microRNA-21A-5p associati à Toxoplasma gondii è a classificazione di tumore.Avemu ancu investigatu i livelli di mRNA di i geni associati à i tumori in e cellule di glioma U87 alterendu i livelli di miR-21 in esosomi è l'effettu di l'esosomi nantu à a proliferazione di cellule di glioma U87 umanu.In esosomi di cellule di glioma U87 infettate da Toxoplasma gondii, l'espressione di microRNA-21 hè aumentata è l'attività di i geni antitumorali (FoxO1, PTEN è PDCD4) hè ridutta.L'esosomi derivati ​​​​di BV2 infettati da Toxoplasma inducenu a proliferazione di cellule di glioma U87.L'esosomi induce a crescita di e cellule U87 in un mudellu di tumore di mouse.Suggeremu chì l'aumentu di miR-21 exosomalu in a microglia BV2 infettata da Toxoplasma pò ghjucà un rolu impurtante cum'è promotore di a crescita cellulare in i celluli di glioma U87 per downregulating genes antitumorali.
Hè stimatu chì più di 18,1 milioni di casi di cancru avanzatu sò stati diagnosticati in u mondu in u 2018, cù circa 297 000 tumuri di u sistema nervu cintrali diagnosticati ogni annu (1,6% di tutti i tumuri)1.Ricerche precedenti anu dimustratu chì i fatturi di risichi per u sviluppu di tumuri cerebrali umani includenu diversi prudutti chimichi, storia di famiglia è radiazioni ionizzanti da l'equipaggiu terapeuticu è diagnosticu di a testa.Tuttavia, a causa esatta di sti malignità hè scunnisciuta.Circa u 20% di tutti i cancers in u mondu sò causati da agenti infettivi, cumpresi virus, batteri è parassiti3,4.I patogeni infettivi disturbanu i miccanismi genetichi di a cellula ospiti, cum'è a riparazione di l'ADN è u ciculu cellulare, è ponu purtà à inflammazioni croniche è danni à u sistema immune5.
L'agenti infizziosi assuciati à u cancer umanu sò i patogeni virali più cumuni, cumpresi i papillomavirus umani è l'hepatitis B è C virus.I parassiti ponu ancu ghjucà un rolu potenziale in u sviluppu di u cancer umanu.Diversi spezie parasite, à dì Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis è Hymenolepis nana, sò stati implicati in varii tipi di cancru umanu 6,7,8.
Toxoplasma gondii hè un protozou intracellulare chì regula u microambientu di e cellule ospiti infettate.Stu parasite hè stimatu per infettà circa 30% di a pupulazione di u mondu, mettendu a pupulazione sana in risicu9,10.Toxoplasma gondii pò infettà l'organi vitali, cumpresu u sistema nervu cintrali (CNS), è causanu malatie gravi cum'è meningitis è encefalite fatali, in particulare in i pazienti immunocompromessi9.Tuttavia, Toxoplasma gondii pò ancu alterà l'ambienti di l'ospite infettatu modulendu a crescita di e cellule è e risposte immune in individui immunocompetenti, purtendu à u mantenimentu di una infezione cronica asintomatica9,11.Curiosamente, datu a correlazione trà a prevalenza di T. gondii è l'incidenza di u tumore cerebrale, certi rapporti suggerenu chì i cambiamenti ambientali di l'ospiti in vivo per l'infezzione cronica di T. gondii s'assumiglia à u microambientu tumorale.
L'esosomi sò cunnisciuti cum'è comunicatori intercellulari chì furniscenu cuntenutu biologicu, cumprese proteine ​​​​è acidi nucleici, da e cellule vicine16,17.L'esosomi ponu influenzà i prucessi biologichi ligati à u tumore, cum'è l'anti-apoptosi, l'angiogenesi è a metastasi in u microambientu tumorale.In particulare, i miRNAs (miRNAs), picculi RNA non codificanti di circa 22 nucleotidi di lunghezza, sò impurtanti regulatori di geni post-trascrizionali chì cuntrolanu più di u 30% di l'mRNA umanu per mezu di u cumplessu di silenziu induciutu da miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii pò disturbà i prucessi biologichi cuntrullendu l'espressione di miRNA in ospiti infettati.I miRNA di l'ospiti cuntenenu segnali impurtanti per regulà i prucessi biologichi di l'ospiti per ottene a strategia di sopravvivenza di u parassitu.Cusì, studià i cambiamenti in u prufilu di miRNA di l'ospitu nantu à l'infezzione cù T. gondii pò aiutà à capisce l'interazzione trà l'ospiti è T. gondii più chjaramente.Infatti, Thirugnanam et al.15 suggerì chì T. gondii prumove a carcinogenesi di u cervellu alterendu a so espressione nantu à i miRNA di l'ospiti specifichi assuciati à a crescita di tumore è truvaru chì T. gondii pò causà gliomi in animali sperimentali.
Stu studiu fucalizza nantu à l'alterazione di miR-21 exosomal in microglia host infettata cù Toxoplasma BV2.Avemu osservatu un rolu pussibile di miR-21 esosomale alteratu in a crescita di e cellule di glioma U87 per via di a ritenzione in u nucleu di FoxO1 / p27, chì hè u mira di miR-21 overexpressed.
L'esosomi derivati ​​​​da BV2 sò stati ottenuti cù centrifugazione differenziale è validati da diversi metudi per prevene a contaminazione cù cumpunenti cellulari o altre vesicule.L'elettroforesi di gel SDS-poliacrilamide (SDS-PAGE) hà dimustratu mudelli distinti trà e proteine ​​​​estratte da e cellule BV2 è esosomi (Figura 1A), è i campioni sò stati valutati per a presenza di Alix, chì hè stata analizata da Western blotting di marcatori di proteine ​​​​esosomali in .L'etichettatura Alix hè stata truvata in i proteini exosomi, ma micca in i proteini lisati di cellula BV2 (Fig. 1B).Inoltre, l'RNA purificatu da esosomi derivati ​​da BV2 hè statu analizatu cù un bioanalizzatore.I subunità ribosomiali 18S è 28S sò stati raramente osservati in u mudellu di migrazione di RNA esosomale, chì indica una purezza affidabile (Figura 1C).Infine, a microscopia elettronica di trasmissione hà dimustratu chì l'exosomi osservati eranu circa 60-150 nm in grandezza è avianu una struttura di tazza tipica di a morfologia exosoma (Fig. 1D).
Caratterizzazione di esosomi derivati ​​da cellule BV2.(A) Pagina di scheda di dati di sicurezza.E proteini sò stati isolati da e cellule BV2 o esosomi derivati ​​da BV2.I mudelli di proteine ​​​​differiscenu trà e cellule è esosomi.(B) Analisi Western blot di un marcatore esosomale (Alix).(C) Valutazione di l'RNA purificatu da e cellule BV2 è esosomi derivati ​​​​di BV2 utilizendu un bioanalizzatore.Cusì, i subunità ribosomiali 18S è 28S in e cellule BV2 sò raramente truvati in l'RNA esosomali.(D) A microscopia elettronica di trasmissione hà dimustratu chì l'esosomi isolati da e cellule BV2 sò stati macchiati negativamente cù u 2% d'acetate d'uranyl.L'esosomi sò circa 60-150 nm in grandezza è in forma di tazza (Song è Jung, dati inediti).
L'internalizazione cellulare di esosomi derivati ​​da BV2 in cellule di glioma umanu U87 hè stata osservata cù a microscopia confocale.L'esosomi marcati PKH26 sò localizzati in u citoplasma di e cellule U87.I nuclei sò stati macchiati cù DAPI (Fig. 2A), chì indicanu chì l'exosomi derivati ​​​​di BV2 ponu esse internalizzati da e cellule di l'ospiti è influenzanu l'ambienti di e cellule receptore.
L'internalizzazione di esosomi derivati ​​da BV2 in cellule di glioma U87 è esosomi derivati ​​da BV2 infettati da Toxoplasma RH induce a proliferazione di cellule di glioma U87.(A) Esosomi inghiottiti da cellule U87 misurati da microscopia confocale.I celluli di glioma U87 sò stati incubati cù esosomi marcati cù PKH26 (rossu) o senza cuntrollu per 24 ore.I nuclei sò stati macchiati cù DAPI (blu) è dopu osservatu sottu un microscopiu confocale (scala bar: 10 μm, x 3000).(B) A proliferazione di cellule di glioma U87 hè stata determinata da un test di proliferazione cellulare.I celluli di glioma U87 sò stati trattati cù exosomi per u tempu indicatu. * P < 0,05 hè stata ottenuta da u test t di Student. * P < 0,05 hè stata ottenuta da u test t di Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * P < 0,05 da u test t di Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 ottenutu cù u test t di Student.
Dopu avè cunfirmatu l'internalizazione di esosomi derivati ​​da BV2 in cellule di glioma U87, avemu realizatu analisi di proliferazione cellulare per investigà u rolu di esosomi derivati ​​da Toxoplasma BV2 in u sviluppu di cellule di glioma umanu.U trattamentu di e cellule U87 cù l'esosomi da e cellule BV2 infettate da T. gondii hà dimustratu chì l'exosomi derivati ​​​​da BV2 infettati da T. gondii causanu una proliferazione significativamente più alta di i celluli U87 cumparatu cù u cuntrollu (Fig. 2B).
Inoltre, a crescita di e cellule U118 hà avutu i stessi risultati cum'è U87, postu chì l'exosomi stimulati da Toxoplasma anu causatu i più alti livelli di proliferazione (dati micca mostrati).Basatu nantu à sti dati, pudemu indicà chì l'esosomi infettati da Toxoplasma da BV2 ghjucanu un rolu impurtante in a proliferazione di cellule di glioma.
Per investigà l'effettu di l'esosomi derivati ​​​​da BV2 infettati da Toxoplasma nantu à u sviluppu di tumore, avemu injected cellule di glioma U87 in topi nudi per un mudellu di xenograft è injected exosomi derivati ​​​​di BV2 o esosomi derivati ​​​​di BV2 infettati da RH.Dopu chì i tumuri sò diventati evidenti dopu à 1 settimana, ogni gruppu sperimentale di 5 topi hè statu divisu secondu a dimensione di u tumore per determinà u listessu puntu di partenza, è a dimensione di u tumore hè stata misurata per 22 ghjorni.
In i topi cù u mudellu di xenograft U87, u pesu è u pesu di u tumore significativamente più grande sò stati osservati in u gruppu exosome RH-infettatu da BV2 in u ghjornu 22 (Fig. 3A, B).Per d 'altra banda, ùn ci era micca una differenza significativa in a dimensione di u tumore trà u gruppu di exosomi derivati ​​​​di BV2 è u gruppu di cuntrollu dopu u trattamentu di l'esosomi.Inoltre, i topi injected with glioma cells and exosomes visually displayed the most tumor volume in the group of RH-infected BV2-derivated exosomes (Fig. 3C).Questi risultati dimustranu chì l'esosomi infettati da Toxoplasma BV2 induce a crescita di glioma in un mudellu di tumore di u mouse.
Oncogenèse (AC) d'exosomes dérivés de BV2 dans un modèle de souris xenograft U87.A dimensione di u tumore (A) è u pesu (B) anu aumentatu significativamente in i topi nudi BALB/c trattati cù esosomi infettati da RH derivati ​​da BV2.I topi nudi BALB/c (C) sò stati iniettati per via sottucutanea cù 1 x 107 cellule U87 sospese in una mistura di Matrigel.Sei ghjorni dopu à l'iniezione, 100 μg d'esosomi derivati ​​da BV2 sò stati trattati in topi.A dimensione è u pesu di u tumore sò stati misurati in i ghjorni indicati è dopu à u sacrifiziu, rispettivamente. * P < 0,05. * P < 0,05. * Р < 0,05. * P < 0,05. * P < 0,05. * P < 0,05. * Р < 0,05. * P < 0,05.
I dati dimustranu chì 37 miRNAs (16 overexpressed and 21 downexpressed) assuciati cù l'immunità o u sviluppu di u tumore sò stati alterati significativamente in a microglia dopu l'infezzione cù a ceppa Toxoplasma RH (Fig. 4A).I livelli di espressione relative di miR-21 trà i miRNA alterati sò stati cunfirmati da RT-PCR in tempu reale in esosomi derivati ​​​​da BV2, esosomi trattati cù cellule BV2 è U87.L'espressione di miR-21 hà dimustratu un incrementu significativu di l'esosomi da e cellule BV2 infettate da Toxoplasma gondii (strain RH) (Fig. 4B).I livelli di espressione relative di miR-21 in i celi BV2 è U87 anu aumentatu dopu l'uptake of exosomes alterati (Fig. 4B).I livelli relative di l'espressione miR-21 in i tessuti cerebrali di i malati di tumore è i topi infettati cù Toxoplasma gondii (strain ME49) eranu più altu ch'è in cuntrolli, rispettivamente (Fig. 4C).Questi risultati correlanu cù e differenze trà i livelli d'espressione di microRNA previsti è cunfirmati in vitro è in vivo.
Cambiamenti in l'espressione di miP-21a-5p exosomal in microglia infettata da Toxoplasma gondii (RH).(A) Dimostra cambiamenti significativu in siRNA assuciatu cù l'immunità o u sviluppu di tumore dopu l'infezzione di T. gondii RH.(B) I livelli di espressione relative di miR-21 sò stati rilevati da RT-PCR in tempu reale in esosomi derivati ​​​​di BV2, esosomi trattati da BV2 è cellule U87.(C) I livelli di espressione miR-21 relative sò stati trovati in i tessuti cerebrali di i malati di tumore (N = 3) è i topi infettati da Toxoplasma gondii (ceppa ME49) (N = 3). * P < 0,05 hè stata ottenuta da u test t di Student. * P < 0,05 hè stata ottenuta da u test t di Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 hè stata ottenuta cù u test t di Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 ottenutu cù u test t di Student.
L'exosomi da e cellule BV2 infettate da RH hà purtatu à a crescita di gliomi in vivo è in vitro (Fig. 2, 3).Per detectà i mRNA pertinenti, avemu esaminatu i livelli di mRNA di geni di destinazione antitumorali, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN, è a morte cellulare programata 4 (PDCD4) in cellule U87 infettate da esosomi derivati ​​​​da BV2 o RH BV2.L'analisi bioinformatica hà dimustratu chì parechji geni assuciati à i tumori, cumpresi i geni FoxO1, PTEN è PDCD4, anu siti di legame miR-2121,22.I livelli di mRNA di i geni di destinazione antitumorali sò stati ridotti in l'exosomi derivati ​​​​di BV2 infettati da RH cumparatu cù l'exosomi derivati ​​da BV2 (Fig. 5A).FoxO1 hà dimustratu livelli ridotti di proteina in esosomi derivati ​​​​da BV2 infettati da RH paragunatu à esosomi derivati ​​​​da BV2 (Figura 5B).Basatu nantu à questi risultati, pudemu cunfirmà chì l'esosomi derivati ​​​​da BV2 infettatu da RH diminuiscenu i geni anti-oncogeni, mantenendu u so rolu in a crescita di tumore.
Esosomi derivati ​​​​da BV2 infettati da Toxoplasma RH induce a suppressione di geni antitumorali in cellule di glioma U87 da esosomi derivati ​​​​da BV2 infettati da Toxoplasma RH.(A) PCR in tempu reale di l'espressione FoxO1, PTEN è PDCD4 in esosomi derivati ​​da T. gondii RH-infected BV2 cumparatu cù esosomi PBS.L'ARNm di β-actina hè stata utilizata cum'è cuntrollu.(B) L'espressione FoxO1 hè stata determinata da Western blotting è i dati di densitometria sò stati valutati statisticamente cù u prugramma ImageJ. * P < 0,05 hè stata ottenuta da u test t di Student. * P < 0,05 hè stata ottenuta da u test t di Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 hè stata ottenuta cù u test t di Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 ottenutu cù u test t di Student.
Per capiscenu l'effettu di miP-21 in l'esosomi nantu à a regulazione di u genu assuciatu à u tumore, i celluli U87 sò stati trasfettati cù un inhibitore di miP-21 cù Lipofectamine 2000 è e cellule sò state raccolte 24 ore dopu a trasfezzione.FoxO1 è p27 expression levels in cells transfected with miR-21 inhibitors sò stati paragunati à e cellule trattate cù esosomi derivati ​​da BV2 cù qRT-PCR (Fig. 6A, B).A trasfezzione di l'inibitore di miR-21 in e cellule U87 hà diminuitu significativamente l'espressione FoxO1 è p27 (FIG. 6).
MiP-21 esosomale derivato da BV2 infettato da RH alterava l'espressione FoxO1/p27 in cellule di glioma U87.E cellule U87 sò state trasfettate cù l'inibitore di miP-21 cù Lipofectamine 2000 è e cellule sò state raccolte 24 ore dopu a trasfezzione.I livelli di espressione di FoxO1 è p27 in e cellule trasfettate cù l'inibitori di miR-21 sò stati paragunati à i livelli in e cellule trattate cù esosomi derivati ​​da BV2 cù qRT-PCR (A, B).
Per scappà da a risposta immune di l'ospiti, u parassitu Toxoplasma si trasforma in un cisti tissutale.Parasitanu diversi tessuti, cumpresu u cervellu, u cori è u musculu scheleticu, per tutta a vita di l'ospiti è modulanu a risposta immune di l'ospiti.Inoltre, ponu regulà u ciculu cellulare è l'apoptosi di e cellule ospiti, prumove a so proliferazione14,24.Toxoplasma gondii infetta principalmente cellule dendritiche ospiti, neutrofili e monociti/macrofagi, compresa la microglia cerebrale.Toxoplasma gondii induce a differenziazione di macrophages di u fenotipu M2, affetta a guariscenza di ferite dopu l'infezzione patogena, è hè ancu assuciatu cù ipervascularizazione è fibrosi granulomatosa.Questa patogenesi cumportamentale di l'infezzione Toxoplasma pò esse ligata à i marcatori assuciati à u sviluppu di tumore.L'ambiente ostili regulatu da Toxoplasma pò s'assumiglia à u precancer currispundente.Dunque, si pò assume chì l'infezzione Toxoplasma duverà cuntribuisce à u sviluppu di tumuri cerebrali.In fatti, i tassi elevati di infezzjoni Toxoplasma sò stati rappurtati in u serum di i malati cù diversi tumuri cerebrali.Inoltre, Toxoplasma gondii pò esse un altru efectu carcinogenic è agisce sinergicamente per aiutà à altri carcinogeni infizziosi à sviluppà tumuri cerebrali.In questu sensu, vale a pena nutà chì u P. falciparum è u virus Epstein-Barr cuntribuiscenu sinergicamente à a furmazione di limfoma di Burkitt.
U rolu di l'esosomi cum'è regulatori in u campu di a ricerca di u cancer hè statu assai investigatu.Tuttavia, u rolu di l'esosomi trà i parassiti è l'ospiti infettati resta pocu capitu.Finu a ora, diversi regulatori, cumprese i proteini secreti, anu spiegatu i prucessi biologichi per quale i parassiti protozoi resistenu à l'attaccu di l'ospiti è perpetuate l'infezzione.Ricertamenti, ci hè statu un cuncettu crescente chì i microvesicule associati à i protozoi è i so microRNA interagiscenu cù e cellule d'ospiti per creà un ambiente favurevule per a so sopravvivenza.Dunque, più studii sò necessarii per scopre a relazione trà i miRNA exosomali alterati è a proliferazione di cellule di glioma.L'alterazione di MicroRNA (cluster genes miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 è miR-17-92) si lega à u promotore STAT3 in i macrofagi umani infettati da toxoplasma, hè regulatu è induce anti -apoptosi in risposta à l'infezione da Toxoplasma gondii 29 .L'infezzione di Toxoplasma aumenta l'espressione di miR-17-5p è miR-106b-5p, chì sò assuciati cù parechje malatie hyperproliferative 30 .Questi dati suggerenu chì i miRNA di l'ospiti regulati da l'infezzione di Toxoplasma sò molécule impurtanti per a sopravvivenza di parassiti è a patogenesi in u cumpurtamentu biologicu di l'ospiti.
I miRNA alterati ponu influenzà diversi tipi di cumpurtamentu durante l'iniziu è a progressione di e cellule maligne, cumpresi i gliomi: autosufficienza di signali di crescita, insensibilità à i signali di crescita, evasione di apoptosi, potenziale replicativu illimitatu, angiogenesi, invasione è metastasi, è inflammazioni.In glioma, i miRNA alterati sò stati identificati in parechji studii di profilazione di espressione.
In u presente studiu, avemu cunfirmatu alti livelli di espressione di miRNA-21 in cellule ospiti infettate da toxoplasma.miR-21 hè statu identificatu cum'è unu di i microRNA più frequentemente sovraespressi in tumuri solidi, cumpresi gliomi, 33 è a so espressione correlate cù u gradu di glioma.L'accumulazione di evidenza suggerisce chì miR-21 hè un novu oncogenu chì agisce cum'è un fattore anti-apoptoticu in a crescita di glioma è hè assai sopraespresso in i tessuti è u plasma di malignità di u cervellu umanu.Curiosamente, l'inattivazione di miR-21 in e cellule di glioma è i tessuti provoca l'inibizione di a proliferazione cellulare per l'apoptosi dipendente da caspase.L'analisi bioinformatica di i miri previsti di miR-21 hà revelatu parechji geni soppressori di tumore assuciati à i percorsi di apoptosi, cumprese a morte cellulare programata 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN è forkhead box O1 (FoxO1), cù u situ di legame miR-2121..22.38.
FoxO1, cum'è unu di i fatturi di trascrizzione (FoxO), hè implicatu in u sviluppu di varii tipi di cancru umanu è pò regulà l'espressione di geni suppressori di tumore cum'è p21, p27, Bim è FasL40.FoxO1 pò ligà è attivà l'inibitori di u ciculu cellulare cum'è p27 per suppressione a crescita cellulare.Inoltre, FoxO1 hè un effetore chjave di a signalazione PI3K / Akt è regula parechji prucessi biologichi cum'è a progressione di u ciculu cellulare è a differenziazione cellulare per l'attivazione di a trascrizione p2742.
In cunclusioni, credemu chì l'exosomal miR-21 derivati ​​​​da a microglia infettata da Toxoplasma pò ghjucà un rolu impurtante cum'è regulatore di crescita di e cellule di glioma (Fig. 7).In ogni casu, più studii sò necessarii per truvà un ligame direttu trà miR-21 exosomal, infezzione alterata da Toxoplasma, è crescita di glioma.Questi risultati sò previsti per furnisce un puntu di partenza per studià a relazione trà l'infezzione Toxoplasma è l'incidenza di glioma.
Un schema schematicu di u mecanismu di a carcinogenesi di glioma (cervellu) hè prupostu in stu studiu.L'autore disegna in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Tutti i protokolli sperimentali in stu studiu, cumpresu l'usu di l'animali, sò stati in cunfurmità cù e Linee Etiche Standard di u Cumitatu di l'Usuariu di l'Università Naziunale di Seoul, è sò stati appruvati da u Cunsigliu di Revisione Istituzionale di a Scola di Medicina di l'Università Naziunale di Seoul (numeru IRB SNU- 150715).-2).Tutte e prucedure spirimintali sò state realizate in cunfurmità cù i cunsiglii ARRIVE.
A microglia di mouse BV2 è e cellule di glioma umanu U87 sò stati cultivati ​​in u Mediu di l'Aquila Modificatu di Dulbecco (DMEM; Welgene, Seoul, Corea) è u Mediu di l'Istitutu Memoriale di Roswell Park (RPMI; Welgene), rispettivamente, ciascuna cuntenente 10% di siru bovinu fetale, 4 mM l- glutammina, penicillina 0,2 mM e streptomicina 0,05 mM.Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 5% de CO2 à 37°C.Un'altra linea di cellula di glioma, U118, hè stata utilizata per paragunà cù e cellule U87.
Per isolà l'esosomi da i ceppi RH è ME49 infettati da T. gondii, i tachyzoitis di T. gondii (strain RH) sò stati colti da a cavità abdominal di i topi BALB / c di 6 settimane injected 3-4 ghjorni prima.I tachizoiti sò stati lavati trè volte cù PBS è purificati per centrifugazione in 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Per ottene tachizoiti di a ceppa ME49, i topi BALB / c sò stati injectati intraperitoneally cù 20 cisti tissutali è a trasfurmazioni di tachizoiti in cisti hè stata cullata da lavà a cavità abdominal in u 6-8 ghjornu dopu l'infezzione (PI).I topi infettati cù PBS.I tachizoiti ME49 sò stati cultivati ​​in cellule supplementate cù 100 μg/ml di penicillina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml di streptomicina (Gibco/BRL) è 5% di siero fetale bovinu (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) à 37 °C et à 5 % de dioxyde de carbone.Dopu à a cultura in cellule Vero, i tachyzoiti ME49 sò stati passati duie volte à traversu una agulla di calibre 25 è dopu à traversu un filtru di 5 µm per sguassà i detriti è e cellule.Dopu à lavà, i tachizoiti sò stati risuspenditi in PBS44.I cisti tissutali di u ceppo ME49 di Toxoplasma gondii sò stati mantenuti per iniezione intraperitoneale di cisti isolati da u cervellu di topi C57BL/6 infettati (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Corea).I cervelli di i topi infettati da ME49 sò stati raccolti dopu à 3 mesi di PI è macinati sottu un microscopiu per isolà i cisti.I topi infettati sò stati manteni in cundizioni speciali senza patogeni (SPF) in a Scola di Medicina di l'Università Naziunale di Seoul.
L'RNA tutale hè stata estratta da esosomi derivati ​​da BV2, cellule BV2 è tessuti cù u miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) secondu l'istruzzioni di u fabricatore, cumpresu u tempu d'incubazione per u passu di eluzione.A cuncentrazione di RNA hè stata determinata nantu à un spettrofotometru NanoDrop 2000.A qualità di i microarrays di RNA hè stata valutata cù un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Paesi Bassi).
DMEM cun 10% di FBS povera di esosomi hè stata preparata per ultracentrifugazione à 100.000 g per 16 ore à 4 ° C è filtrata attraversu un filtru di 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).E cellule BV2, 5 × 105, sò state cultivate in DMEM chì cuntene 10% di FBS esosomi è 1% antibiotici à 37 ° C è 5% CO2.Dopu à 24 ore d'incubazione, i tachizoiti di a ceppa RH o ME49 (MOI = 10) sò stati aghjuntu à e cellule è i parassiti non invasori sò stati eliminati in una ora è ripienu cù DMEM.L'esosomi da e cellule BV2 sò stati isolati da centrifugazione differenziale mudificata, u metudu più utilizatu.Risospendere l'esosoma pellet in 300 µl di PBS per l'analisi di RNA o proteine.A cuncentrazione di esosomi isolati hè stata determinata cù un kit di analisi di proteina BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) è un spettrofotometru NanoDrop 2000.
I precipitati da cellule BV2 o esosomi derivati ​​​​da BV2 sò stati lisati in una soluzione di estrazione di proteine ​​​​PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Corea) è e proteine ​​​​sono state caricate su gel di poliacrilammide 10% SDS color blu brillante Coomassie.Inoltre, i proteini sò stati trasferiti à membrani PVDF per 2 ore.Western blots sò stati validati cù l'anticorpu Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) cum'è un marcatore esosomale.HRP-conjugated capra anti-mouse IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) è un LAS-1000 plus luminescent image analyzer (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) sò stati usati com'è anticorpu secundariu..A microscopia elettronica di trasmissione hè stata realizata per studià a dimensione è a morfologia di l'esosomi.L'esosomi isolati da e cellule BV2 (6,40 µg/µl) sò stati preparati nantu à e maglie rivestite di carbone è macchiati negativamente cù acetate d'uranyle 2% per 1 min.I campioni preparati sò stati osservati à una tensione accelerata di 80 kV utilizendu un JEOL 1200-EX II (Tokyo, Giappone) equipatu di una camera CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
L'exosomi derivati ​​​​di BV2 sò stati macchiati cù u PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per 15 minuti à a temperatura di l'ambienti.E cellule U87, 2 × 105, cù esosomi marcati PKH26 (rossu) o senza esosomi cum'è cuntrollu negativu, sò stati incubati à 37 ° C per 24 ore in un incubatore di 5% CO2.I nuclei di e cellule U87 sò stati macchiati cù DAPI (blu), e cellule U87 sò stati fissati in 4% paraformaldehyde per 15 min à 4 ° C è poi analizati in un sistema di microscopiu confocale Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Germania).osservabile.
L'ADNc hè stata sintetizzata da siRNA utilizendu a sintesi di u primu filu Mir-X siRNA è u kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Giappone).A PCR quantitativa in tempu reale hè stata realizata utilizendu u sistema di rilevazione PCR in tempu reale iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) utilizendu primers è mudelli mischiati cù SYBR Premix.L'ADN hè statu amplificatu per 40 cicli di denaturazione à 95 ° C per 15 s è annealing à 60 ° C per 60 s.I dati di ogni reazione PCR sò stati analizati utilizendu u modulu di analisi di dati di u software di sistema otticu iQ™5 (Bio-Rad).I cambiamenti relativi in ​​l'espressione genica trà i geni target selezziunati è β-actin/siRNA (è U6) sò stati calculati utilizendu u metudu di curva standard.E sequenze di primer usate sò mostrate in a Tabella 1.
3 x 104 cellule di glioma U87 sò state seminate in piastre da 96 pozzetti è mischiate cù esosomi infettati da Toxoplasma derivati ​​​​da BV2 (50 μg/mL) o exosomi senza pulsazioni derivati ​​​​da BV2 (50 μg/mL) cum'è cuntrolli à 12, 18 è 36 ore. .A rata di proliferazione cellulare hè stata determinata cù u Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Figuri Supplementari S1-S3) 46 .
I topi nudi BALB/c di femmina di 5 settimane sò stati acquistati da Orient Bio (Seongnam-si, Corea di u Sud) è manteni individualmente in gabbie sterili à a temperatura di l'ambienti (22±2 °C) è l'umidità (45±15 °C).%) à a temperatura di l'ambienti (22±2 ° C) è l'umidità (45±15%).Un ciculu di luce di 12 ore è un ciculu scuru di 12 ore sò stati realizati sottu SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).I topi sò stati divisi aleatoriamente in trè gruppi di 5 topi ognunu è tutti i gruppi sò stati iniettati per via sottucutanea cù 400 ml di PBS chì cuntenenu 1 x 107 cellule di glioma U87 è BD Matrigel™ ridottu di fattore di crescita (BD Science, Miami, FL, USA).Sei ghjorni dopu à l'iniezione di tumore, 200 mg d'esosomi derivati ​​​​da cellule BV2 (cù / senza infezzjoni Toxoplasma) sò stati injectati in u situ di u tumore.Vinti dui ghjorni dopu à l'infezzione di tumore, a dimensione di u tumore di i topi in ogni gruppu hè stata misurata cù un caliper trè volte à settimana, è u voluminu di u tumore hè statu calculatu da a formula: 0,5 × (larghezza) × 2 × lunghezza.
Analisi di l'espressione di MicroRNA utilizendu miRCURYTM LNA miRNA array, 7th generation has, mmu and rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Danimarca) chì copre 1119 topi ben caratterizati trà 3100 sonde di cattura di miRNA umani, topi è ratti.Duranti sta prucedura, da 250 à 1000 ng di RNA tutale hè stata eliminata da u 5'-fosfatu da u trattamentu cù fosfatasi alkaline intestinali di vitellu seguita da l'etichettatura cù un colorante fluorescente verde Hy3.I campioni etichettati sò stati poi hibridizzati caricando diapositive di microarray utilizendu un kit di camera d'ibridazione (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) è un kit di diapositive di ibridazione (Agilent Technologies).L'ibridazione hè stata fatta per 16 ore à 56 ° C, dopu i microarrays sò stati lavati in cunfurmità cù i cunsiglii di u fabricatore.I diapositivi di microarray processati sò stati poi scannati cù un sistema di scanner di microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).L'imaghjini scansati sò stati impurtati cù a versione di software Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies) è l'intensità di fluorescenza di ogni maghjina hè stata quantificata utilizendu u schedariu GAL corrispondente di u protocolu Exiqon mudificatu.I dati di Microarray per u studiu attuale sò dipositati in a basa di dati GEO sottu u numeru d'accessu GPL32397.
I profili d'espressione di miRNA esosomali maturi in microglia di ceppi RH o ME49 infettati da Toxoplasma sò stati analizati cù diversi strumenti di rete.I miRNA assuciati à u sviluppu di tumore sò stati identificati cù miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) è filtrati cù intensità di signale normalizzata (log2) più grande di 8.0.Trà i miRNAs, i miRNAs espressi di manera differenziale sò stati truvati per esse più di 1,5 volte alterati da l'analisi di filtru di miRNA alterati da i ceppi RH o ME49 infettati da T. gondii.
Le cellule sono state seminate in piastre a sei pozzetti (3 x 105 cellule/pozzetto) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).E cellule trasfettate sò cultivate per 6 ore è dopu u mediu hè cambiatu à mediu cumpletu frescu.I celluli sò stati colti 24 ore dopu a trasfezzione.
L'analisi statistiche hè stata realizata principalmente utilizendu a prova t di Studente cù u software Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Per l'analisi sperimentale di l'animali, una ANOVA bidirezionale hè stata realizata cù u software Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). I valori P < 0,05 sò stati cunsiderati statisticamente significativi. I valori P < 0,05 sò stati cunsiderati statisticamente significativi. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. I valori P <0.05 sò stati cunsiderati statisticamente significativi. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. I valori P <0.05 sò stati cunsiderati statisticamente significativi.
Tutti i protokolli sperimentali utilizati in stu studiu sò stati appruvati da u Cunsigliu di Revisione Istituzionale di a Scola di Medicina di l'Università Naziunale di Seoul (numeru IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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